Western Blot 免疫印跡實驗服務（WB）代做免疫印跡Western Blotting實驗，代做WB實驗預實驗！常用抗體！內參抗體！內參蛋白檢測！保證質量，實驗結果滿意才支付尾款！步驟一：檢測樣本蛋白的準

上海維景生物科技有限公司是一家專注生命科學領域的企業，借助中科院細胞與免疫學實驗平臺，擁有強大的資金背景支持和專業的團隊等資源。

上海維景生物是一家面向全國以專業從事免疫學實驗服務外包和免疫學試劑代理銷售為主的高新技術企業。公司的服務對象主要為醫藥科研人員、大型制藥公司等。

公司專注開展以下五種免疫學實驗服務：免疫印跡（Western Blotting）、免疫組織化學（IHC）、免疫沉淀(IP)、免疫共沉淀(Co-IP)、染色質免疫共沉淀(ChIP) 。絕對保證實驗質量，客戶滿意后才收取尾款。

同時公司還是美國CMCTAG品牌的全國獨家總代理，CMCTAG公司產品專注于標簽抗體、內參抗體及標簽抗體偶聯beads這一領域。其開發的標簽抗體偶聯agarose beads（affinity gel）在科研以及臨床研究中享有很高的聲譽，更借助CMCTAG在標簽抗體、內參抗體領域的優勢，成為免疫印跡WB和免疫沉淀IP實驗試劑的專業供應商。因卓越的產品質量及良好的客戶口碑，CMCTAG敢于執行倒賠政策，抗體承諾客戶不滿意即可申請無條件全額退款，如若產品質量證實有瑕疵，則除了無條件全額退款以外，還會倒賠客戶一定金額。

維景生物是一家專注標簽抗體偶聯beads（affinity gel），標簽抗體，HRP直標標簽抗體，內參抗體等抗體銷售,及WB,IP,Co-IP,ChIP實驗外包服務的高科技生物公司,咨詢熱線:021-52682952。 業務咨詢 QQ :908869532

代做免疫印跡Western Blotting實驗，代做WB實驗

預實驗！常用抗體！保證質量，實驗結果滿意才支付尾款！
Western Blot標準protocol
成功完成Western Blot檢測，必須滿足4個條件：

1. 凝膠洗脫：轉移期間蛋白質必須從凝膠中洗脫出來，如果蛋白質還截留在凝膠中，將無法在膜上進行分析
2. 吸附到膜上：在轉移過程中蛋白質必須吸附到膜上，如果蛋白不吸附，將無法在膜上進行分析
3. 處理期間仍截留在膜上：在轉移后的處理過程中蛋白質必須保持吸附在印跡膜上
4. 處理過程中可接近：被吸附的蛋白質必須能夠與檢測試劑接觸，如果蛋白質被掩蓋則無法檢測

成功進行WB檢測，則設置合適正確的對照是必不可少的，只要正確設置了這些對照，即可快速和準確的找到WB的問題所在，并保證實驗結果的準確性和特異性！一般需要設置的對照如下：

• 陽性對照：明確表達檢測蛋白的組織或細胞，用于檢測抗體的工作效率
• 陰性對照：明確不表達檢測蛋白組織或細胞，用于檢測抗體的特異性
• 二抗對照：不加一抗，用于檢測二抗的特異性
• 內參對照：檢測標本的質量和二抗系統
• 空白對照：不加一抗和二抗；用于檢測膜的性質和封閉的效果

WB檢測基本過程
1、獲取細胞或組織裂解物
1)根據檢測蛋白的位置選擇合適的裂解buffer：

蛋白位置	推薦buffer
全細胞	NP-40 or RIPA
胞漿（可溶性蛋白）	Tris-HCl
胞漿（骨架結合蛋白）	Tris-Triton
膜蛋白	NP-40 or RIPA
核蛋白	RIPA or 核蛋白提取試劑盒
線粒體蛋白	RIPA or 線粒體分離試劑盒

亦可購買商業化的蛋白提取試劑盒來保證標本制備的質量
2)選擇合適的蛋白酶抑制劑，避免蛋白降解，從而保證檢測的準確性！
2、蛋白定量
常用的蛋白定量方法：Bradford assay, Lowry assay 或BCA assay。定量后，可根據情況將標本保存在-20°C /-80°C備用，進行免疫沉淀（IP）或者直接進行電泳分離蛋白
3、電泳分離蛋白質
根據待測蛋白狀態確定電泳條件：

待測蛋白狀態	凝膠條件	上樣buffer	電泳buffer
Reduced - Denatured	還原，變性	含β-巰基乙醇或DTT，含SDS	含SDS
Reduced - Native	還原，不變性	含β-巰基乙醇或DTT，不含SDS	不含SDS
Oxidized - Denatured	不還原，變性	不含β-巰基乙醇或DTT，含SDS	含SDS
Oxidized - Native	不還原，不變性	不含β-巰基乙醇或DTT，不含SDS	不含SDS

根據待測蛋白分子量大小確定凝膠濃度

蛋白分子量（kDa）	凝膠濃度（％）
4-40	20
12-45	15
10-70	12.5
15-100	10
25-200	8

4、轉膜
根據不同的檢測目的和待測蛋白的特性，選擇合適的膜類型。常用的轉移膜類型有：PVDF膜、硝酸纖維素膜（NC膜）和尼龍膜，其中PVDF和NC膜的使用頻率zui高。各種膜的技術參數及比較如下：

	PVDF膜	NC膜	尼龍膜
靈敏度和分辨率	高	高	高
背景	低	低	較高
蛋白結合能力	100-200ug/cm2（適用于SDS存在時與蛋白結合）	80-100ug/cm2	>400ug/cm2
機械強度	強	干的膜易脆	軟而結實
溶劑抗性	強	差	差
使用前是否需要浸潤	甲醛潤濕	緩沖液潤濕	緩沖液潤濕
適用染色方法	膠體金、麗春紅、酰胺黑、印度墨汁、考馬斯亮蘭	膠體金、麗春紅、酰胺黑、印度墨汁	不能用陰離子染料
適用檢測方法	顯色法、化學發光、熒光、放射性、化學熒光、快速免疫檢測	顯色法、化學發光、熒光、放射性	顯色、化學發光、放射性
適用范圍	普通蛋白WB、糖蛋白檢測、蛋白質測序、氨基酸分析、重復檢測	普通蛋白WB、氨基酸分析、重復檢測。0.1um膜適用于7kDa以下蛋白	低濃度小分子蛋白、酸性蛋白、糖蛋白、蛋白多糖、核酸檢測常用
價格	高	較低	低

5、封閉
去掉膜上多余的非特異性結合位點，降低背景。常用的封閉溶液有：含BSA或者脫脂奶粉的TBST或TBS
6、一抗孵育
一抗的選擇成功與否，是整個WB實驗成功的關鍵：選擇一抗有以下幾個注意點：

• 選擇適合檢測標本種屬的一抗（說明書有驗證）
• 選擇適用于WB實驗方法的一抗（說明書有驗證）
• 選擇單克隆抗體或者經過親和純化的多克隆抗體

一抗的保存和使用：

• 根據說明書的要求條件進行抗體的保存；一般需要將抗體分裝后放入-20度保存，避免反復凍融。
• 抗體的工作液現配現用，在4度保存不要超過2周
• 根據說明書推薦濃度使用TBST稀釋一抗。由于實驗室條件和檢測方法等的差異，說明書推薦的稀釋比例只作參考，需要在說明書推薦的濃度周邊進行多個濃度梯度的實驗檢測，然后選擇信噪比的抗體濃度進行實驗。如果說明書沒有推薦濃度，可進行多個稀釋比例進行摸索稀釋度（1:100-1:3000）。
• 孵育條件：推薦4°C孵育（一般大于18個小時），根據抗體親和力不同孵育時間有所區別

內參的選擇和使用：WB過程監測以及目的蛋白定量的標準！
WB常用內參及其技術參數：

內參名稱	分子量大小	適用范圍
beta-actin	43kDa	胞漿和全細胞
GAPDH	30-40kDa	胞漿和全細胞
Tubulin	55kDa	胞漿和全細胞
VCDA1/Porin	31kDa	線粒體
COXIV	16kDa	線粒體
TBP	38kDa	細胞核

7、二抗孵育
根據說明書推薦濃度使用TBST稀釋一抗。如果說明書沒有推薦濃度，可進行多個稀釋比例進行摸索稀釋度（1:1000-1:20000）。孵育條件一般為室溫1-2小時
8、底物孵育
選擇顯色或者化學發光底物。一般傾向于化學發光，靈敏度高且背景低，節省抗體用量
9、結果分析和檢測
凝膠成像系統檢測或者暗室曝光到膠片
Note：從封閉開始，每步之間都需要用TBST進行洗滌，3次，每次5min


客戶注意事項

1.標本收集與保存
組織樣品：新鮮組織放入液氮或-80度保存，組織不少于100mg（約綠豆大小）；
培養細胞：通過細胞計數取不少于2000000個細胞于EP管，加入0.5ml生理鹽水或蛋白保護劑，混勻后保存于冰箱（-80℃，避免反復凍融）；
血液細胞標本：以抗凝管保存血樣或以淋巴細胞分離液分離細胞后加入0.5ml生理鹽水或蛋白保護劑，保存（-80℃可長期保存，避免反復凍融）
血清或細胞培養液標本：離心去掉雜質后取上清入EP管，保存（以上4℃可保存15-20天，-80℃可長期保存，避免反復凍融）

2.樣本運輸：可選以下任何的一種方式寄送標本
組織樣本、細胞樣本使用干冰覆蓋后通過泡沫盒運輸；
細胞樣本也可以直接常溫寄送細胞培養瓶（parafilm密封瓶口保證不污染，培養液不外漏，細胞不必長得太滿，50%左右即可，灌滿培養液）；

以上樣本快遞，視路途遠近2-3天可到達。

上海維景生物科技有限公司是一家專注生命科學領域的企業，借助中科院細胞與免疫學實驗平臺，擁有強大的資金背景支持和專業的團隊等資源。公司面向市場，迅速發展，廣納英才，現已建成專業生命科學產品銷售團隊，其中大部份是在生命科學市場上工作多年，有豐富的銷售經驗，也有良好的客戶資源，銷售渠道覆蓋華東大部分工業以及科研客戶，團隊中免疫學及相關專業碩士以上學歷人士達50%，有較強的技術支持能力，在針對專業技術服務中能夠提供完善周到的專業化服務，對客戶在使用產品過程中提出的問題能滿意答復，并可及時傳遞新的產品技術資料信息。　　

上海維景生物是一家面向以專業從事免疫學實驗服務外包和免疫學試劑代理銷售為主的高新技術企業。公司的服務對象主要為醫藥科研人員、大型制藥公司等。

公司專注開展以下五種免疫學實驗服務：免疫印跡（Western Blotting）、免疫組織化學（IHC）、免疫沉淀(IP)、免疫共沉淀(Co-IP)、染色質免疫共沉淀(ChIP) 。保證實驗質量，客戶滿意后才收取尾款。

同時公司還是美國CMCTAG品牌的總代理，CMCTAG公司產品專注于標簽抗體、內參抗體及標簽抗體偶聯beads這一領域。其開發的標簽抗體偶聯agarose beads（affinity gel）在科研以及臨床研究中享有很高的聲譽，更借助CMCTAG在標簽抗體、內參抗體領域的，成為免疫印跡WB和免疫沉淀IP實驗試劑的專業供應商。因的產品質量及良好的客戶口碑，CMCTAG敢于執行倒賠政策，抗體承諾客戶不滿意即可申請無條件全額退款，如若產品質量證實有瑕疵，則除了無條件全額退款以外，還會倒賠客戶一定金額。

維景生物是一家專注標簽抗體偶聯beads（affinity gel），標簽抗體，HRP直標標簽抗體，內參抗體等抗體銷售,及WB,IP,Co-IP,ChIP實驗外包服務的高科技生物公司,:。 業務咨詢 QQ :908869532

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