CFSE/7-AAD雙染細胞毒性檢測試劑盒是利用細胞熒光染料CFSE(CFDA-SE)和7-AAD對細胞進行染色，利用CFSE標記靶細胞，7-AAD標記死的靶細胞來區分不同的細胞，活的靶細胞成綠色，死的靶細胞成紅色和綠色，從而檢測細胞毒性作用。根據不同的實驗方案設計，可以用來檢測化合物的細胞毒性作用。也可以用來檢測殺傷性T 細胞或NK 細胞

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檢測方法：

● 熒光顯微鏡 ● 流式細胞儀 ● 激光共聚焦

樣本類型：

● 懸浮細胞 ● 貼壁細胞

試劑盒以外自備試劑和儀器:

● 流式細胞儀或熒光顯微鏡或激光共聚焦 ● 離心機 ● CO₂培養箱 ● PBS或者HBSS（不含酚紅） ● 熒光專用黑色96孔板

使用方法：

細胞CFSE染色：

1.根據需要檢測的細胞樣品數，用HBSS將CFSE母液200～4000倍稀釋，配制成CFSE染色工作液。不同的細胞需要根據預實驗結果確定最佳染色濃度。如果熒光強度弱，可以適當提高CFSE的終濃度。如果背景太高，可以適當降低CFSE的終濃度，請摸索條件找到最佳濃度。

【注】：

● 也可以用HBSS等緩沖液或相應的無血清培養基稀釋染料母液至所需濃度。

● 開始實驗前，使用HBSS緩沖液或培養基稀釋CFSE到需要的工作濃度。工作濃度為根據不同細胞的預實驗結果確定的最佳工作濃度，一般染色終濃度200～4000倍稀釋。

● 一般起始濃度按500～1000倍稀釋即可。

● 為了降低過度加載染料導致的潛在背景和細胞毒性，在不影響實驗結果的前提下應盡可能低濃度染色。

● 工作液現配現用。

2.將培養好的待測靶細胞消化后收集，用PBS洗滌2次。

【注】：

● 400×g離心5分鐘。

3.將待測細胞用染色工作液重懸，至細胞濃度大約10⁷/ml。

4.在37℃培養箱中避光孵育15～30分鐘。

5.加10倍體積的含血清培養基，400×g離心5分鐘。

6.離心后去上清，收集細胞，用HBSS或無血清培養基洗滌細胞1～2次，最后加入培養基重懸細胞。

7.在37℃培養箱中孵育20～30分鐘。

細胞模型制備：

1.收集待檢測的靶細胞。

2.進行相應的毒性藥物處理或者效應細胞處理。

【注】：

● 效應細胞和靶細胞比例根據需要自行設定。常見比例如6.25：1；12.5：1；25：1等。

● 活的靶細胞成綠色；死的靶細胞成紅色和綠色；死的效應細胞成紅色，活的效應細胞成無色。

細胞檢測：

1.收集制備好的毒性處理過的細胞模型。

2.用200μL HBSS重懸細胞，加入1μL 7-AAD染色液，混勻。

【注】：

● 微量的染色液注意有效的加入細胞懸液并充分混勻。

● 可以根據預實驗確定的染色液濃度，直接用7-AAD和HBSS緩沖液配制成染色工作液，并用染色工作液重懸細胞。

3.在2～8℃避光孵育10～60分鐘。

4.在400×g離心5分鐘收集細胞。

5.用500μL HBSS或PBS重懸細胞。

6.取500μL細胞懸液，用流式細胞儀或熒光顯微鏡檢測。

7.根據流式結果計算死亡細胞百分率。被殺傷死亡的靶細胞被7-AAD染上會出現在CFSE+7-AAD+區域，未殺傷的在CFSE+7-AAD-區域，得出被殺傷的靶細胞的比例。用這個比例再計算毒性。

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