線粒體膜電位檢測試劑盒(RHO123)是利用Rhodamine 123探針檢測線粒體膜電位變化的試劑盒，可以快速靈敏地檢測細胞、組織或純化的線粒體膜電位變化，可以用于早期的細胞凋亡檢測。

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檢測方法：

● 流式細胞儀 ● 熒光顯微鏡 ● 激光共聚焦

樣本類型：

● 懸浮細胞 ● 貼壁細胞

試劑盒以外自備試劑和儀器：

● 流式細胞儀/激光共聚焦/熒光顯微鏡 ● PBS或HBSS(無酚紅) ● 離心機

注意事項：

● 螺旋蓋微量試劑管裝的試劑在開蓋前請短暫離心，將蓋內壁上的液體收集至管底，避免開蓋時液體灑落。

● 細胞處理需要小心操作,盡量避免人為的損傷細胞。

● 始終保持平衡染液中pH 值的一致性，因為pH 值的變化將影響膜電位。

● 根椐細胞種類、實驗條件不同流式細胞儀設置不同。

● 線粒體膜電位降低，熒光強度減弱。但是結果分析時注意排除熒光淬滅現象，Rho123熒光物質的激發光譜和發射光譜有一部分是重合的，其發射光有一部分(與激發光重合的部分)會被自己重新吸收，而且這種吸收的效益隨著該熒光物質的濃度增加而增強。換而言之，當熒光物質濃度很高的時候其熒光強度和濃度的增加不成正比，此時注意檢測結果的分析。采用JC-1法可以減少熒光淬滅的影響。

使用方法：

懸浮細胞：

1、試劑配制：

1×染色緩沖液配制：

根據樣品數按下列比例配制1×染色緩沖液，取100μL 10×染色緩沖液加900μL純水稀釋，混勻并預熱至37℃，即成1×染色緩沖液；

Rho123染色工作液的配制：

根據樣品數按下列比例配制Rho123染色工作液。在500μL 1×緩沖液中加入4μL Rho123，混勻配成Rho123 染色工作液。

2、收集樣本細胞以及陰性、陽性對照細胞。

3、用PBS洗滌細胞兩次。離心收集細胞。

【注】：

● 300×g -500×g，2-8℃，離心時間5分鐘收集細胞。

4、用500μL Rho123染色工作液將細胞重懸，細胞密度約5-10×10⁵個/ml。37℃，5% CO₂的培養箱中孵育15分鐘。

5、常溫離心收集細胞。 用PBS 洗滌細胞1 次。

【注】：

● 300×g -500×g，離心時間5分鐘收集細胞。

6、用500μL預熱的1×染色緩沖液將細胞重懸。

7、用流式細胞儀或熒光酶標儀/分光光度計檢測分析結果，或用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察結果。

貼壁細胞：

對于貼壁細胞，可以先收集細胞，重懸后參考懸浮細胞的檢測方法。

純化線粒體：

1、把配制好的RHO123染色工作液再用RHO123孵育緩沖液(1×)稀釋5倍。

2、0.9mL 5倍稀釋的RHO123染色工作液中加入0.1mL總蛋白量為10～100μg的純化的線粒體。

3、結果檢測。

組織樣本：

組織樣本可以用玻璃勻漿器勻漿成單細胞懸液后按照細胞樣本的方法檢測。也可以用其他細胞懸液制備的試劑盒處理組織后檢測。

結果分析：

檢測時可以把激發光設置為490nm，發射光設置為530nm。

線粒體膜電位降低，熒光強度減弱。

用流式細胞儀檢測細胞線粒體膜電位的情況。

也可用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察；用熒光分光光度計或熒光酶標儀檢測。

常見問題分析：

● 出現凋亡細胞熒光強度高于正常對照細胞的情況？

Rho123染色檢測線粒體膜電位時，理論上一般正常情況均是隨著細胞凋亡，線粒體膜電位降低，熒光強度減弱。但是Rho123染料的特性決定不同的細胞類型、染色方式、染液濃度、染色與處理的順序等因素都可以明顯影響Rho123的染色結果。其中影響最顯著的是細胞ΔΨm(Rho123的總攝入)、細胞質膜的Pgp(P-糖蛋白)/MRP(多藥耐藥相關蛋白)(Rho123的胞內保留)和Rho123的self-quenching等3個因素。

當某些模型中質膜Pgp 外排的影響或者線粒體中Rho123濃度很高導致的熒光self-quenching的影響超過了MMP 降低的影響時，會出現凋亡細胞(膜電位降低細胞)的熒光強于對照細胞的現象，但此時胞內的Rho123主要分布于胞漿中，而不是線粒體內。

還有一些比較少見的情況是，有些模型的ΔΨm在細胞凋亡早期會有一過性升高，Rho123染色會一過性增強，如果檢測的時間點恰好重合，也會出現凋亡細胞熒光強度高于正常對照細胞的現象。

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