細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒(中性紅法)是利用細(xì)胞對中性紅的攝入能力來檢測細(xì)胞增殖或細(xì)胞毒性。中性紅可以被活細(xì)胞所攝入，并在溶酶體中積累。在細(xì)胞增殖加快時，細(xì)胞數(shù)量增多，可以攝入的中性紅的量就會增加。在細(xì)胞受到損傷時，中性紅的攝入能力會下降。這樣通過對于中性紅攝入量的不同就可以確定細(xì)胞的增殖或毒性情況

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樣本類型：

● 懸浮細(xì)胞 ● 貼壁細(xì)胞

試劑盒以外自備試劑和儀器：

● CO₂培養(yǎng)箱 ● 帶540nm濾光片的酶標(biāo)儀/分光光度計 ● PBS或HBSS（無酚紅） ● 96孔培養(yǎng)板

使用注意事項：

● 中性紅染色液長期存放會產(chǎn)生沉淀。出現(xiàn)結(jié)晶可以37℃水浴后搖勻溶解，染液是過量的，可以直接吸取染色液的上清液使用，也可以使用針頭濾器等過濾去除沉淀后繼續(xù)使用，不會影響使用效果。

● 96孔板在細(xì)胞培養(yǎng)過程中會存在蒸發(fā)問題。在加入中性紅染色液前，如果培養(yǎng)液存在明顯的蒸發(fā)問題，會影響細(xì)胞的生長狀態(tài)，并嚴(yán)重影響后續(xù)的檢測結(jié)果。

● 部分藥物可能對檢測有影響，有影響時需換液后檢測，無影響時直接檢測。用培養(yǎng)基或PBS 來配制待檢測藥物，加入中性紅試劑，測藥物溶液在540 處的吸光度。如果該吸光度與不含藥物僅加中性紅試劑的培養(yǎng)基或PBS 吸光度差異不大，則可以直接加入中性紅，如果吸光度相對較大，則需要除去培養(yǎng)基，并用新鮮培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞兩次，然后加入新的200μL培養(yǎng)基和20μL中性紅進(jìn)行檢測。

● 如果樣品為高渾濁度的細(xì)胞懸液，或者為了去除其它顏色物質(zhì)的影響，建議設(shè)定690nm作為參比波長，以O(shè)D540扣除參比波長的OD值即可。

● 加中性紅后孵育時間的長短根據(jù)細(xì)胞的類型和細(xì)胞的密度等實驗情況而定，對于大多數(shù)情況孵育2小時即可，有些細(xì)胞需要培養(yǎng)較長時間。

● 檢測貼壁細(xì)胞時，中間的換液、洗滌等步驟如有漂浮細(xì)胞，需收集漂浮細(xì)胞和貼壁細(xì)胞后合并染色。部分細(xì)胞失去貼壁能力而漂浮于培養(yǎng)基，此部分細(xì)胞對結(jié)果有顯著影響，不可隨意丟棄，需離心后收集與貼壁細(xì)胞一起檢測，才能全面的反映出細(xì)胞的整體情況。

● 96孔板液體應(yīng)使用移液器吸出，不可傾倒。一次處理過多的孔，加液時操作時間過長，可導(dǎo)致細(xì)胞干燥失水而死。懸浮細(xì)胞以及一些貼壁不牢的細(xì)胞會因傾倒而丟失。

● 以下以96孔板每孔200μL為例，如果不是使用96孔板檢測，中性紅溶液的用量相應(yīng)等比例增加即可。

使用方法：

1、收集細(xì)胞，加細(xì)胞懸液200μL（約10000個細(xì)胞）到96孔板（邊緣孔用無菌水或PBS填充）。每板設(shè)對照（加200μL培養(yǎng)基）。

2、置37℃，5% CO₂孵育過夜，倒置顯微鏡下觀察。

3、每孔加入10μL待檢測藥物溶液，37℃孵育。

【注】：

● 此處以藥物處理細(xì)胞為例，實際以自己的細(xì)胞樣品為準(zhǔn)。

● 用各種其他方法制備的細(xì)胞模型按下面方法加入中性紅試劑后檢測即可。

● 設(shè)置好適當(dāng)?shù)年幮詫φ蘸完栃詫φ铡?

4、至待檢測時間點，每孔加入20μL中性紅溶液，37℃孵育1-4小時。

【注】：

● 此處以96孔板加樣為例，實際檢測時以自己的細(xì)胞培養(yǎng)容器為準(zhǔn)。

● 按培養(yǎng)基的用量的10%比例添加中性紅試劑即可。

● 如果培養(yǎng)基中的藥物不會對后續(xù)檢測產(chǎn)生干擾，直接加入20μL中性紅染色液；如果培養(yǎng)基中的藥物可能會對后續(xù)檢測產(chǎn)生干擾，先用PBS、DPBS或HBSS等適當(dāng)溶液洗滌1-2次，隨后加入200μL新鮮的細(xì)胞培養(yǎng)基，并加入20μL中性紅染色液。

● 一般2小時即可。對于細(xì)胞密度非常低，細(xì)胞代謝速率非常慢的情況，可以把孵育時間延長到3-4個小時。

● 染色后可以在顯微鏡下檢測細(xì)胞狀態(tài)，細(xì)胞內(nèi)應(yīng)看到暗紅色膜泡，如果顯微鏡有黃色濾光片，可看到更清晰的亮紅色膜泡。

5、移除含有中性紅染色液的細(xì)胞培養(yǎng)基，用PBS、DPBS或HBSSS等適當(dāng)溶液洗滌1-2次。

【注】：

● 檢測貼壁細(xì)胞時，中間的換液、洗滌等步驟如有漂浮細(xì)胞，需收集漂浮細(xì)胞和貼壁細(xì)胞后合并染色。部分細(xì)胞失去貼壁能力而漂浮于培養(yǎng)基，此部分細(xì)胞對結(jié)果有顯著影響，不可隨意丟棄，需離心后收集與貼壁細(xì)胞一起檢測，才能全面的反映出細(xì)胞的整體情況。

6、加入200μL中性紅檢測裂解液，室溫?fù)u床上裂解20分鐘。在搖床上搖動可以促進(jìn)樣品的裂解。

7、測定540nm各孔的吸光值。

8、同時設(shè)置空白孔（培養(yǎng)基和中性紅溶液，無細(xì)胞），對照孔（不加藥培養(yǎng)基和中性紅溶液，有細(xì)胞），每組設(shè)定3-5復(fù)孔。

【注】：

● 復(fù)孔數(shù)量根據(jù)自己實際需要設(shè)定，為了降低試劑消耗成本，可以少設(shè)復(fù)孔。

結(jié)果分析：

細(xì)胞活力計算：

將各測試孔的OD值減去調(diào)零孔OD值或?qū)φ湛譕D值。各重復(fù)孔的OD值取平均數(shù)。

細(xì)胞活力%=（加藥細(xì)胞OD-空白OD）/（對照細(xì)胞OD-空白OD）×100

常見問題分析：

● 檢測時需要換液嗎？

如果待測藥物有還原性，需要換液，否則不需要。
● 如何判斷待測藥物是否含有還原性？

測定不含細(xì)胞，僅含有待測藥物的溶液加入中性紅反應(yīng)后的在540nm處的空白吸光度。如果該吸光度很小，說明待測藥物沒有還原性或還原性很小，對中性紅沒有影響，則可以不換液，在培養(yǎng)基中直接加入中性后；如果吸光度相對較大，說明藥物具有較強的還原性，則需要除去含藥物的培養(yǎng)基，并用新鮮培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞兩次，然后加入新的200μL培養(yǎng)基和20μL中性紅進(jìn)行檢測。

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