地gāo辛隨引物標(biāo)記和檢測試劑盒Ⅰ的品牌是百奧萊博，是優(yōu)質(zhì)的探針標(biāo)記及檢測產(chǎn)品，本制品用于科研試驗(yàn)，我公司專注于探針標(biāo)記及檢測產(chǎn)品的研發(fā)、生產(chǎn)和供應(yīng)，為您提供的地gāo辛隨引物標(biāo)記和檢測試劑盒Ⅰ質(zhì)量可靠，批間差小，且價格公道，熱切盼望您選購我們的產(chǎn)品。

北京百奧萊博科技有限公司是一家專業(yè)的生物試劑銷售公司。公司主要經(jīng)營血清、抗原、抗體等生物試劑產(chǎn)品，可以為您提供專業(yè)的技術(shù)服務(wù)，以優(yōu)良的價格、優(yōu)質(zhì)的服務(wù)、優(yōu)先的理念，滿足客戶的各方面的需求，與國內(nèi)多家企業(yè)、單位建立了良好的長期合作關(guān)系，擁有較好的企業(yè)信譽(yù)和品牌形象。 主營產(chǎn)品:血清、抗體、抗原、核酸提取、核酸純化等生化試劑

特別提示：包括dì高辛隨引物標(biāo)記和檢測試劑盒Ⅰ(POD)在內(nèi)，本公司的所有產(chǎn)品僅可用于科研實(shí)驗(yàn)，嚴(yán)禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途！

產(chǎn)品名稱：dì高辛隨引物標(biāo)記和檢測試劑盒Ⅰ(POD)
產(chǎn)品貨號：ZN1518
產(chǎn)品規(guī)格：1盒

保存條件：-20℃冰凍保存。
保存期：一年
用途：用于 DNA 探針的隨機(jī)引物標(biāo)記及各種膜上雜交和原位雜交。
工作量：可用于標(biāo)記0.1—3μg的探針 6次及 1000 張切片的原位雜交或12次 10×10cm 膜上雜交檢測。
原理：
所謂 DNA 探針，實(shí)質(zhì)上是一段已知的基因片段，應(yīng)用這一基因片段即可與待測樣品雜交。
如果靶基因和探針的核苷酸序列相同，就可按堿基配對原則進(jìn)行核酸分子雜交，從而達(dá)到檢查樣品基因的目的。在隨機(jī)引物法標(biāo)記反應(yīng)液中，有隨機(jī)合成的六聚體核苷酸(hexanucleotide)作為引物，
dATP、dCTP、dGTP、dTTP和 D1G-11-dUTP 作為合成底物，以單鏈 DNA 作為模板，在 Klenow 酶的作用下，合成摻入dì高辛的DNA 鏈。以dì高辛標(biāo)記的探針與靶基因DNA 鏈雜交后，再通過免疫反應(yīng)來
進(jìn)行檢測。一般通過酶標(biāo)抗dì高辛抗體來檢測，就可以肯定雜交反應(yīng)的存在。
免疫檢測采用過氧化物酶系統(tǒng)，DAB 顯色。敏感性很高。可用于膜上雜交和原位雜交。特點(diǎn)：
(1)標(biāo)記屬標(biāo)記反應(yīng)。以1μg DNA 探針為例，1 小時反應(yīng)即可產(chǎn)生0.8μg 標(biāo)記探針，20 小時可產(chǎn)生2μg 左右的標(biāo)記探針。
(2)試劑將標(biāo)記反應(yīng)所需的引物、核苷酸、DIG-11dUTP和Klenow 酶等混合在一起。一次標(biāo)記只需吸取一次標(biāo)記液，使用至為簡便。
(3)標(biāo)記反應(yīng)適于下述對象：
a.DNA 從10ng—3μg。
b.不等的DNA 長度100bp—10kb。
c.線形排列或呈高度卷曲之DNA。
d.低融點(diǎn)瓊脂中的DNA。
(4)檢測系統(tǒng)抗體為抗dì高辛單抗+SABC。抗dì高辛單抗標(biāo)記生物素，效價1：1000-2000(膜上雜交)或1：1000(原位雜交)。
(5)顯色劑為DAB，非常穩(wěn)定。用時1：40 稀釋。
(6)試劑盒敏感性達(dá)到0.1pg，足夠檢測出1μg 基因組DNA 中的單個基因。
(7)除用于各種膜上雜交之外，還可用于原位雜交(ISH)。
操作程序：
一 隨機(jī)引物標(biāo)記操作程序如下：
①用滅菌去離子蒸餾水稀釋 1μg DNA 至總體積 16μl。
②DNA 熱變性：把 DNA 瓶置于沸水中，水浴 10分鐘。然后，迅速地插入碎冰中 3分鐘以上。
③加 4μl DIG Random Labeling Mix(),混勻后再離心 2000/r.p.m×5分鐘。
④置 37℃反應(yīng)至少 120分鐘。時間越長，產(chǎn)量越高。延長反應(yīng)時間至 20 小時可明顯增加dì高辛標(biāo)記DNA的產(chǎn)量。應(yīng)根據(jù)需要控制反應(yīng)時間。
⑤加入 2μ 1 10mM EDTA 以中止反應(yīng)，對于原位雜交和膜上雜交反應(yīng)來說，標(biāo)記反應(yīng)可告結(jié)束，上述反應(yīng)液置-20℃保存至少一年以上。且可反復(fù)使用。
二 核酸探針膜上雜交原理和操作
(一)雜交總原則
脫氧核苷酸通過磷酸二酯鍵縮合成長鏈構(gòu)成 DNA的一級結(jié)構(gòu)。兩條堿基互補(bǔ)的多核苷酸鏈按堿基配對原則形成雙螺旋，構(gòu)成 DNA的二級結(jié)構(gòu)。某些條件(如酸堿、有機(jī)溶劑、加熱)可使氫鍵斷裂，DNA 雙鏈打開成單鏈重新結(jié)合。所謂雜交，是具有一定互補(bǔ)順序的核酸單鏈，DNA 單鏈仍然可與序列同源的單鏈按堿基互補(bǔ)原則結(jié)合成異源性雙鏈的過程。
(二)雜交膜的選擇
雜交膜可以選擇硝酸纖維素膜和尼龍膜。硝酸纖維膜的優(yōu)點(diǎn)在于本底較低，但只能用于顯色性檢測，且不能用于重復(fù)雜交。尼龍膜分為帶正電荷的膜和不帶電荷的膜兩種。帶正電荷的尼龍膜對核酸結(jié)合力強(qiáng)，敏感性也較高。不帶電荷的膜結(jié)合力低，相應(yīng)敏感性也較低。尼龍膜的優(yōu)點(diǎn)在于雜交用過的膜，用洗脫液(0.1×SSC，0.1%SDS)煮沸 5-10分鐘后去除探針，可用于新的探針雜交。如果對雜交結(jié)果不滿意，如背景太高或顯色不強(qiáng)，也可洗去探針之后重新雜交。
(三)探針濃度
探針濃度是獲得理想雜交檢測的關(guān)鍵因素，濃度太高則會導(dǎo)致本底太深；若濃度太低又會導(dǎo)致信號減弱。為了解決過高探針濃度所引起的高背景，必須進(jìn)行模擬雜交實(shí)驗(yàn)。
所謂模擬雜交實(shí)驗(yàn)，即選擇幾小片雜交膜，在未轉(zhuǎn)移 DNA的情況下，進(jìn)行封閉、不同濃度的探針孵育及隨后的免疫檢測。以背景能被接受的zuì高探針濃度為正式雜交實(shí)驗(yàn)的濃度。模擬雜交實(shí)驗(yàn)不 同濃度的探針可以參考下述方法配制：取 5μl 標(biāo)記反應(yīng)液加 1ml 探針稀釋液，混勻。取 0.5ml 等倍釋后，再取 0.5ml 繼續(xù)等倍稀釋。假設(shè) 20μl 標(biāo)記反應(yīng)液中含 1μg 標(biāo)記的探針，則系列稀釋探針的濃度分別是：200ng/ml、100ng/ml、50ng/ml、25ng/ml、12.5ng/ml、6.25ng/ml。
(四)預(yù)雜交和雜交液
預(yù)雜交和雜交都使用相同緩沖液，不同的僅僅是預(yù)雜交液中不含有探針。下面是幾種基本雜交液配方：
①Standard buffer：5×SSC,0.1%(w/v)N-Lauroylsarcosine,0.02%(w/v)SDS,1% Blocking Reagent。
②Standard buffer+50% formamide∶50% formamide(deionized),5×SSC,0.1%(W/V)N-Lauroy lsarcosine,0.02%(w/v)SDS,2% Blocking Reagent。
③High SDS buffer(Church buffer):7%SDS,50% formamide(deionized),5 ×SSC,2% Blocking Reagent,50mM Sodiμm Phosphate,0.1% N-Lauroylsarcosine
(五)Southern Blotting 
DNA 片段經(jīng)電泳分離后按分子量大小排列在瓊脂糖凝膠上。1975 年 Southern 發(fā)明了利用濃鹽溶液的推動作用將變性的單鏈 DNA 轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上的方法，解決了原位轉(zhuǎn)移的問題。雖然其原理和操作均很簡單，卻是基因分析中必不可少的手段，已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用。
Southern 印跡雜交包括兩個主要步驟①把電泳分級的DNA 轉(zhuǎn)移到固相支持膜上。②與標(biāo)記的DNA 探針雜交。
1．Southern 轉(zhuǎn)移
先將 DNA 用限制性內(nèi)切酶消化。準(zhǔn)備一定濃度的瓊脂凝膠。瓊脂凝膠必須是高純度和核酸級的。電泳后經(jīng)溴化乙錠染色并在紫外燈下照相后，將需要轉(zhuǎn)移的瓊脂糖凝膠切下，放入搪瓷盤中，然后進(jìn)行下面的步驟。
試劑
a.0.25M HC1
b.變性液：0.5N NaoH,1.5M Nac1
c.中和度：0.5M Tris-HC1,pH7.4,3M Nac1
d.20×SSC：0.3M 檸檬酸鈉,3M Nac1
e.2×SSC：0.03M 檸檬酸鈉,0.3M Nac1
程序：
(1)將膠浸入 0.25M HC1 中 10分鐘。HC1 處理的作用主要是通過去嘌呤使 DNA 分子斷裂，因而有利于高分子量 DNA的轉(zhuǎn)移，但不能處理時間過長。要轉(zhuǎn)移全部小于 10kb的DNA片段時可省略此步驟。
(2)進(jìn)入變性液之前，用蒸餾水漂洗20-30分鐘。
(3)把膠浸入變性液中，室溫浸泡 15分鐘×2次。
(4)蒸餾水漂洗凝膠 2次。
(5)把膠浸入中和液中，室溫泡 15分鐘×2次。
(6)在處理凝膠的同時，切一張與膠同樣大小的尼龍膜或硝酸纖維膜。硝酸纖維膜用 2×SSC浸泡。
剪兩張 Whatman3#濾紙和一疊吸水用的粗濾紙注意不能用手指直接觸及膜面。
(7)準(zhǔn)備轉(zhuǎn)移用平器和支架，平器中放 20×SSC。架子上搭濾紙橋使溶液能夠虹吸上來。
(8)依次放：處理好的凝膠，硝酸纖維素膜，吸水濾紙，玻璃板，適量重物(500-1000g)
注意：要檢查 PH 值，用硝纖膜時 PH<9。要確保各層間沒有氣泡，否則會發(fā)生局部“緣”，氣泡處的DNA 難以被吸到硝酸纖維膜上。
(9)于室溫轉(zhuǎn)移 12-20 小時。
(10)取出轉(zhuǎn)移膜，用 2×SSC 漂洗數(shù)次，以去掉可能粘附于膜上的凝膠。
(11)固定：可選擇下述方法之一進(jìn)行 DNA 固定
·紫外線固定：使用長波紫外線照射 10-20分鐘，簡單漂洗后干燥備用。
·尼龍膜置+120℃烘烤 30分鐘。
·硝纖膜置真空烤箱中，80℃減壓烘烤 2-2.5 小時，以避免硝纖膜自熔。若無真空烤箱，亦可在普通烤箱中 65-70℃烘烤 3-4 小時，也能達(dá)到固定目的。固定后，將膜封于塑料袋中，保存于干燥處待雜交。
注意事項(xiàng)①轉(zhuǎn)移液的鹽濃度對轉(zhuǎn)移具有一定影響。應(yīng)選擇 20×SSC 快。10×SSC 轉(zhuǎn)移速度較快，對于高分子量 DNA(〉10Kb)效果比較理想。因此要根據(jù)不同目的選擇適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)移液。
②轉(zhuǎn)移時不能移動上邊重物，防止出現(xiàn)“重影”現(xiàn)象。
③硝酸纖維膜對于 0.5kb 以下的小分子 DNA 結(jié)合不牢，轉(zhuǎn)移時容易丟掉。要探測小片時zuì好用尼龍膜。
2 ．Southern 印跡雜交雜交成功的關(guān)鍵因素之一在于選擇雜交液。應(yīng)通過預(yù)實(shí)驗(yàn)來選擇合適的雜交液。另一個比較重要的因素是標(biāo)記探針的濃度，一般選擇 5-25ng/ml，應(yīng)通過模擬雜交實(shí)驗(yàn)來選擇合適的探針濃度。
試劑
a.Standard buffer
b.Standard buffer+50% formamide
c.High SDS buffer
d.Wash Solution I:2XSSC,0.1%SDS
e.Wash Solution Ⅱ:0.5XSSC,0.1%SDS
程序
①將轉(zhuǎn)移好的尼龍膜或硝纖膜裝入塑料袋中，每邊各留 2-4mm 空隙。灌注雜交液的一邊留1cm 空隙。在角上剪開一個小口，灌注預(yù)雜交液，從切口處趕走氣泡，用封膜機(jī)封口，浸入水浴中。
②根據(jù)所選擇的不同預(yù)雜交液，采用不同的溫度預(yù)雜交 4-20 小時：Standard buffer:預(yù)雜交溫度 65-68℃，Standard buffer+50% formamide:37-42℃，High SDS buffer:37-42℃。
③使用雙鏈 DNA 探針時，沸水浴 10分鐘以變性探針。然后迅速插入冰中。
按模擬雜交實(shí)驗(yàn)所確定的探針濃度將適量探針加入到預(yù)雜交液中，配成雜交液，一般濃度5-25ng/ml。按每100cm2膜加入至少3.5ml配制雜交液。
④使用和預(yù)雜交相同的雜交溫度，一般雜交 16-20 小時。
⑤雜交結(jié)束后，取出雜交袋，剪開一個小口，將雜交液倒入帶蓋的試管中，儲存于-20℃以備下次使用。這樣至少可保存一年。再次使用之前應(yīng)在凍融之后，加熱至+95℃10分鐘以變性探針。雜交液如含有 50%甲酰胺，則在 68℃變性 10分鐘即可。
⑥取出雜交膜，用 Wash Solution I洗5分鐘×3次。
⑦保溫沖洗：用 Wash SolutionⅡ于 68℃沖洗15分鐘×2次。
(六)· DNA Dot Blotting 
此檢測方法用于快速定性篩選 DNA。樣品可以是純化 DNA，也可以是細(xì)胞碎片 PCR 擴(kuò)的DNA。預(yù)雜交和雜交方法與 Southern 基本一致，不同的僅是樣品的處理不同。
試劑：DNA dilution buffer∶10mM Tris-HC1；1mM EDTA,PH8.0；50μg/ml herring Sperm DNA
程序
①將樣本DNA稀釋成不同濃度。
②將樣本DNA于+95℃水浴 10分鐘，迅速插入冰中。
③取 1μl點(diǎn)樣至尼龍膜或硝纖膜上。點(diǎn)樣前先畫上圓卷做記號。
④用紫外線照射固定或+120℃烘烤30分鐘固定。
其后雜交步驟 Southern 相同
(七)DAB 顯色檢測法
試劑：
a．.Biotin—Mouse Anti—Digoxin 200μl
b．SABC—POD 200μl
c．DAB Stock Solution 5ml
d.沖洗液：0.1M Tris-HC1,0.15M Nac1,PH7.4。
e.封閉液：1% Blocking Reagent/0.1M Tris-HC1,0.15M Nac1。
f.顯色緩沖液：0.1M PBS,150mM Nacl,PH7.4。
g.TE 緩沖液：10mM Tris,1mM EDTA,PH8.0
程序：
1．經(jīng)過雜交及雜交后的沖洗之后，膜置于沖洗液中平衡 1分鐘。
2．用干凈的雜交袋或平皿，封閉液室溫封閉60分鐘。
3．用沖洗液沖洗5分鐘×3次，每次100ml 。
4．用封閉液(e)1：1000-2000 稀釋 Biotin—Mouse Anti—Digoxin，例如 10μl Biotin—Mouse Anti—Digoxin 加至 10-20ml 封閉液中(稀釋液+4℃可穩(wěn)定 24 小時左右)。將適量稀釋抗體加入雜交袋中 37℃反應(yīng) 1-2 小時。
5．用沖洗液沖洗5分鐘×3次，每次 100ml 。
6．用封閉液(e)1：1000-2000 稀釋 SABC，例如 10μl SABC 加至 10-20ml 封閉液中(稀釋液+4℃可穩(wěn)定 24 小時左右)。將適量稀釋 SABC 加入雜交袋中 37℃反應(yīng) 1-2 小時。
7．用沖洗液沖洗15分鐘×3次，每次 100ml。
8．按 1：40 配制底物顯色液：250μl 儲備液加至 10ml 顯色緩沖液中，用前加zuì終濃度為0.03%的H2O2，室溫顯色5—30分鐘左右。當(dāng)所需要的顯色點(diǎn)或帶出現(xiàn)之后，蒸餾水洗以終止反應(yīng)。結(jié)果可以進(jìn)行照相記錄。還有一種選擇是讓膜干燥保存。
三 原位雜交
所謂原位雜交是指在保存染色體、細(xì)胞或組織結(jié)構(gòu)的前提下，用探針定位檢查出相關(guān)基因序列。結(jié)合免疫細(xì)胞化學(xué)，原位雜交可以揭示出基因在 DNA、mRNA 水平的表達(dá)。
原位雜交技術(shù)zuì早 Pardue and Gall和 John etal。分別在 1969 年發(fā)現(xiàn)。zuì初，放射性標(biāo)記技術(shù)是的方法，其使用受到明顯限制。由于非放射性標(biāo)記技術(shù)的簡單、高敏感性，為原位雜交技術(shù)廣泛應(yīng)用開避了道路。
(一)染色體原位雜交的一般技術(shù)
1 玻片準(zhǔn)備
為了展開染色體，酒精清潔玻片即可。但為了防止細(xì)胞和組織的脫落，必須用多聚賴氨酸或APES 處理玻片。
2 固定
為了保存形態(tài)結(jié)構(gòu)，生物材料都必須予以固定。染色體的固定比較簡單，甲醇/乙酸固定即已足夠。如果是石蠟包埋組織，采用福爾馬林固定。冰凍切片采用 4%甲醛或Bouin"s 固定液固定30分鐘。應(yīng)予注意的是，DNA和 RNA 雖然不和各種交聯(lián)劑反應(yīng)。但包圍 DNA.RNA的各種蛋白質(zhì)和交聯(lián)劑反應(yīng)后，就會遮蓋住靶核苷酸。因此，必須采取各種增加通透性的程序。
3 玻片上材料的預(yù)處理
a．內(nèi)源性酶的滅活
如果用酶作為標(biāo)記物，內(nèi)源性酶必須預(yù)先予滅活。如過氧化物酶，可用 1%H2O2/甲醇30分鐘處理。至于堿性磷酸酶，由于雜交過程的破壞，殘余堿性磷酸酶的活力會完全消失。
b.RNA 酶的處理—DNA-DNA 雜交時需要處理內(nèi)源性 RNA。
內(nèi)源性 RNA的存在，會由于 DNA-RNA的雜交而增加背景。處理方法：DNase-free RAase(100μg/ml)/2×SSC,37℃孵育60分鐘。(SSC=150mM Nac1,15mM Sodiμm Citrate,PH7.4)
c.HC1處理用200mM HC1 處理 20-30分鐘可以增加信/噪比值，其機(jī)理尚不清楚。可能與蛋白的抽提和部分功能核苷酸片斷的溶解有關(guān)。
d.去垢劑處理
在脂膜成分未被固定，脫水、包埋等程序抽提時，可以進(jìn)一步使用去垢劑處理，如 Triton X-100,Sodiμm dodecyl Sulfate 等，同樣有助于原位雜交技術(shù)。
e.蛋白酶消化
蛋白酶消化有助于增進(jìn)探針和核苷酸之間的接觸性。消化通常用蛋白酶 K，溶于 20mM Tris-HC1,2mM Cac12，PH7.4 ,37℃ 15-30分鐘。蛋白酶 K 濃度依不同對象來確定。
例如對染色體和核的分離部分，可以用 1μg/ml 蛋白酶 K。
4 探針和靶基因的變性
對染色體 DNA的原位雜交，必需進(jìn)行變性處理。熱變性越來越常用，它不僅簡單，而且效果很好。對不同的雜交，應(yīng)試驗(yàn)不同的時間和溫度，以找到zuì佳的變性條件。
熱變性時，探針和靶基因可以同時變性。將探針加到玻片上，蓋上蓋玻片。玻片放到 80℃，2分鐘后取出冷卻至 37℃。如果是組織切片，變性時間應(yīng)達(dá)到 80℃10分鐘。組織和細(xì)胞 mRNA的雜交則不需變性處理。
5 雜交后的沖洗
標(biāo)記探針能夠和其序列具有部分同源性的基因非特異性的雜交。這類雜交分子的穩(wěn)定性總是不及完全同源的雜交分子。分別用不同強(qiáng)度沖洗液可以有效地洗掉非特異雜交的/探針，而保留特異雜交的探針。沖洗液的強(qiáng)度可通過改變甲酰胺濃度、鹽濃度和溫度來控制。通常用 2×SSC＋50%甲酰胺來沖洗。有時可用更高強(qiáng)度的沖洗液。總的來說，雜交時用高強(qiáng)度緩沖液，沖洗時用低強(qiáng)度的沖洗液(鹽濃度越低，甲酰胺濃度越高和溫度越高，則沖洗強(qiáng)度越大)。
6 免疫細(xì)胞化學(xué)
免疫細(xì)胞化學(xué)和常規(guī)方法一樣，必須行非特異性的封閉處理。如探針為dì高辛標(biāo)記時，Tris-HC1 緩沖液含“Blocking Reagent”。此外 0.4M NaCl的加入也有助于降低背景。免疫細(xì)胞化學(xué)中zuì常用的酶是過氧化物酶和堿性磷酸酶。前者用 DAB 作顯色劑。后者用 BCIP/NBT 作顯色劑，方法同膜上雜交。顯色強(qiáng)度由顯微鏡下控制。
7 影響原位雜交的主要因素
a.探針長度：原位雜交和其它雜交方法不同，它要求較短的探針。因?yàn)樘结樤蕉蹋瑵B透性越強(qiáng)，可以滲透至細(xì)胞內(nèi)部和染色體。不同的雜交所允許的zuì小核苷酸如下述公式所計(jì)算：
b.探針濃度：濃度越高，則雜交速度越快。但過高的濃度也會使背景增加，因此，宜選擇可接受背景的zuì高探針濃度。
c.硫酸萄聚糖：在水溶液中，硫酸萄聚糖是高度水化物質(zhì)，因此使得大分子(如探針)難以接觸到其結(jié)合水，相對濃度大大增加，雜交速度明顯加快。
d.堿基錯配：堿基錯配會引起雜交速度及二倍體的穩(wěn)定性下降。因此在嚴(yán)格的雜交條件下，可以阻止探針與靶基因的非特異結(jié)合。
e.沖洗條件
8 雜交標(biāo)準(zhǔn)條件
適于 DNA 探針〉100bp
⊙50%去離子甲酰胺
⊙2×SSC
⊙50mM NaH2PO4/Na2HPO4,PH7.0
⊙1mM EDTA
⊙載體 DNA
任選組合：
1×Denhardt`s
dextran sulfate,1-10%
溫度 37-42℃
雜交時間：5-16 小時
(二)組織切片的原位雜交
目前，原位雜交已成病理學(xué)的一個有力工具，原位雜交可以用于諸如病毒，癌基因，基因突變等領(lǐng)域的檢查。尤其是非放射性標(biāo)記探針技術(shù)，為更多的實(shí)驗(yàn)室廣泛應(yīng)用原位雜交創(chuàng)造了條件。對福爾馬林固定、石蠟包埋切片的原位雜交，關(guān)鍵是以下三個步驟：
①靶DNA的暴露。這要靠精心設(shè)計(jì)的消化步驟。
②DNA的變性和雜交。
③雜交的分子的沖洗和檢測。
1 探針的準(zhǔn)備
2 玻片的處理
①去污劑浸泡一晚，大量自來水沖洗，然后用蒸留水清洗。
②干燥之后，浸入丙酮中 3分鐘。
③玻片移入 1：50 丙酮稀釋的APES 溶液中，浸泡 5分鐘。
④玻片用蒸餾水略加清洗。干燥備用。處理后的玻片置干燥無塵環(huán)境可保存半年。玻片也可用“多聚賴氨酸”處理。
3 組織切片的準(zhǔn)備
①組織用常規(guī) 4%中性緩沖甲醛溶液固定，石蠟包埋。
②常規(guī)切片。切片撈于涂有粘片劑的玻片上。
③切片處理：先置 60℃烘片 30分鐘。
二甲苯脫蠟，逐級酒精至水清洗。
④臨用前配制蛋白酶 K 溶液：
儲備液：Proteinase K,10mg/ml H2O，小量分袋-20℃保存。將儲備液用 TES 稀釋成 100μg/ml。
(TES=5mM Tris-HC1,10mM EDTA,10mM Nac1,PH7.4)
⑤每張切片用 Proteinase k 20-30μl 37℃消化 5-15分鐘。消化過程中加蓋硅化蓋玻片，并置濕盒中。注意消化對組織原位雜交是至關(guān)重要的。過度消化會導(dǎo)致切片消失殆盡，消化不足則敏感性不夠，因此應(yīng)針對不同組織嘗試不同的消化條件。
4 雜交
①蛋白K消化后，去除蓋玻片。用4%甲醛 4℃固定5分鐘。
②蒸餾水洗5分鐘。
③讓切片上水分滴下去，并在室溫干燥 5分鐘。注意只能讓切片上水份減少，不能讓切片完全干燥。④每張切片加 5-10μl 探針(大切片需相應(yīng)增加)。
⑤設(shè)立嚴(yán)格的對照組，每張切片加 5-10μl 不加探針的雜交液。
⑥切片上加硅化蓋玻片，將玻片置+95℃變性 6分鐘。
⑦把玻片放到冰上 1分鐘。
⑧切片置溫盒，42℃雜交 3 小時以上。如果方便，應(yīng)雜交過夜。
5 沖洗
去掉蓋玻片，按下述程序沖洗
2×SSC洗5分鐘×2次(室溫)
0．1×SSC洗10分鐘(42℃)
6 雜交分子的免疫檢測
①切片置于 0．1M TBS 緩沖液中，PH7．4
②每張切片加 20-40μl 封閉液：1%Blocking Reagont/0.1M TBS。室溫反應(yīng) 15分鐘。
③用封閉液 1：1000 稀釋 Biotin—Mouse Anti—Digoxin ,每張切片加 20-50μl 稀釋試劑，濕盒室溫反應(yīng) 1-2 小時。用 0．1M TBS洗5分鐘×3次。
④用封閉液 1：1000 稀釋 SABC，37℃反應(yīng) 60分鐘。0．1M TBS洗10分鐘×3次。
⑤配顯色劑：將 DAB 儲備液用 0．1M PBS，PH7．5 緩沖液 1：20 稀釋。加zuì終為0.03%H2O2。
每張切片加 50μl，一般顯色 5-30分鐘。信號弱時顯色延長。
(三)細(xì)胞的原位雜交
下面的程序是用標(biāo)記DNA 探針來檢測培養(yǎng)細(xì)胞中的mRNA。其它類型的檢測可以參照此程序進(jìn)行。1 細(xì)胞準(zhǔn)備，固定和增加通透性注意：所有溶液都必須用 RNase 抑制劑處理。
①玻片用多聚賴氨酸處理。直接用 5% CO2 在玻片上培養(yǎng)細(xì)胞。所用培養(yǎng)基為無酚紅Dulbecco"s 基礎(chǔ)培養(yǎng)基。
②37℃PBS 清洗細(xì)胞。然后用下述固定液室溫固定 30分鐘：4%甲醛，5%乙酸和 0．9%NaC1。
③室溫 PBS 清洗固定細(xì)胞，用 70%乙醇儲存于 4℃
④雜交前用下述方法脫水：70%，90%和 乙醇；10%二甲苯；然后再用 ，90%，70%乙醇，zuì后PBS洗二次。
⑤用胃蛋白酶消化固定細(xì)胞：0.1%Pepsin/0.1N HC1,37℃5-10分鐘。
⑥PBS洗5分鐘后，1%甲醛固定 10分鐘。PBS洗。
其余步驟參照組織切片程序?qū)嵭小?br />
根據(jù)您的關(guān)注的dì高辛隨引物標(biāo)記和檢測試劑盒Ⅰ(POD)，POD，dì高辛隨引物標(biāo)記和檢測試劑盒Ⅰ，dì高辛隨引物標(biāo)記和檢測試劑盒Ⅰ(POD)，ZN1518，百奧萊博，，，您可能還對以下產(chǎn)品有需求：


BTN131036 5′末端同位素標(biāo)記試劑盒 20次
BTN90604C PCR法DNA探針dì高辛標(biāo)記試劑盒 5次
BTN100920 生物素標(biāo)記dUTP溶液(Biotin-11-dUTP) 50μL
BTN120653A 填入法DNA末端標(biāo)記試劑盒 5次
BTN100812 BLOTTO溶液 250mL
BTN91104B Denhardt溶液(非同位素探針) 250mL
BTN100604 鮭魚精DNA溶液 1mL
BTN70904B 酵母tRNA溶液(精提) 1.5mL

關(guān)注dì高辛隨引物標(biāo)記和檢測試劑盒Ⅰ(POD)，POD，dì高辛隨引物標(biāo)記和檢測試劑盒Ⅰ，dì高辛隨引物標(biāo)記和檢測試劑盒Ⅰ(POD)，ZN1518，百奧萊博，，的同時，為您推薦更多您可能感興趣的產(chǎn)品：



名稱：PCR法DNA探針標(biāo)記試劑盒
貨號：BTN90604A
規(guī)格：5次
PCR標(biāo)記的原理是用帶標(biāo)記的dNTP進(jìn)行PCR，zuì后得到的PCR產(chǎn)物將帶有標(biāo)記，可以直接用于雜交試驗(yàn)。其原理示意圖如下：


產(chǎn)品特點(diǎn)：
1.一站式，本試劑盒提供經(jīng)過優(yōu)化的試劑，不需要用戶自己摸索。
2. 足夠10次50μl體系的常規(guī)PCR(用于制備標(biāo)記反應(yīng)的模板和設(shè)置對照反應(yīng))和5次50μl體系的標(biāo)記反應(yīng)。
3.一次標(biāo)記可以得到μg級的雙鏈DNA探針或約700ng的單鏈DNA探針，足夠多次雜交實(shí)驗(yàn)用。
4. 既可用于制備雙鏈探針，也可以用于單鏈探針。
5. 90604A需自備含標(biāo)記核苷酸的dNTP，90604B和90604C分別含生物素和dì高辛標(biāo)記的底物。自備的標(biāo)記包括fluorescein-dUTP、hydroxycoumarin-dUTP、resorufin-dUTP和aminoallyl-dUTP等。
6. 本產(chǎn)品得到的探針參入率一般為4-5%(每100個核苷酸中有4-5個將帶有非同位素標(biāo)記)，有效降低了空間阻礙，檢測效果zuì佳。
7.可以用于Southern和Northern Blot、原位雜交、菌落和斑點(diǎn)印跡雜交等分析。

試劑盒組成：

成分	規(guī)格
2×標(biāo)記專用PCR Mix	500μl
dNTP，2mM each	50μl
含Biotin-11-dUTP的dNTP	25μL(僅B有)
含DIG-11-dUTP的dNTP	25μL(僅C有)
超純水	1ml
說明書	1份

注：標(biāo)記專用PCR Mix不含dNTP。

儲存條件：低溫運(yùn)輸，-20℃保存，有效期一年。

使用方法：

一：準(zhǔn)備工作
1. 按常規(guī)的方法設(shè)計(jì)PCR引物，使探針長度在400-800bp之間。過短則標(biāo)記參入少，探針雜交信號強(qiáng)度減弱；過長則非特異雜交增加，背景變強(qiáng)。
2. 根據(jù)PCR引物優(yōu)化PCR條件。
3. 由于標(biāo)記的dNTP比較珍貴，所以本試劑盒不推薦以基因組DNA或其他復(fù)雜DNA為模板直接進(jìn)行PCR標(biāo)記，而是建議采取下述的兩步法標(biāo)記來提高成功率，即先制備非標(biāo)記PCR產(chǎn)物，再以之為模板制備標(biāo)記的PCR產(chǎn)物。
二：非標(biāo)記PCR產(chǎn)物的制備
4. 設(shè)置50μL PCR的反應(yīng)體系：

成份	用量
2×標(biāo)記專用PCR Mix	25μl
dNTP，2mM each	5μl
自備的探針引物一(10pmol/μL)	1μL(10μM)
自備的探針引物二(10pmol/μL)	1μL(10μM)
自備的模板DNA	1μg基因組DNA或1ng質(zhì)粒DNA
超純水	補(bǔ)到50μL

5. 按已經(jīng)優(yōu)化的PCR參數(shù)進(jìn)行PCR。
6.電泳檢測和膠回收所需的PCR產(chǎn)物，并定量。用10 pmol引物一般能得到1μg左右的PCR產(chǎn)物(具體取決于PCR產(chǎn)物的長度)。注意：zuì好采取膠回收而不是PCR回收以避免殘留引物干擾后續(xù)的標(biāo)記PCR。
三：標(biāo)記PCR反應(yīng)(zuì好做一個不加標(biāo)記的對照用于定量)
說明：在設(shè)置下面反應(yīng)時，如果加一種引物，就得到單鏈標(biāo)記的PCR產(chǎn)物；如果加兩種引物，則得到雙鏈標(biāo)記的PCR產(chǎn)物。由于雙鏈PCR探針在雜交前雖然要變性成單鏈后使用，但雜交時變性的雙鏈彼此還會復(fù)性，這種復(fù)性會與探針-靶DNA雜交反應(yīng)相競爭，降低雜交效率，因此強(qiáng)烈推薦使用單鏈標(biāo)記的DNA探針。

成份	樣品	對照
2×標(biāo)記專用PCR Mix	25μl	25μl
含Biotin-11-dUTP的dNTP或 含DIG-11-dUTP的dNTP或 自備的含其他標(biāo)記dUTP的dNTP	5μl	不加
dNTP，2mM	不加	5μl
雙鏈標(biāo)記：探針引物一和引物二 單鏈標(biāo)記：探針引物一或引物二	每種50 pmol 一種50 pmol	每種50 pmol 一種50 pmol
上步膠純化所得PCR產(chǎn)物 (單鏈標(biāo)記可用100ng)	10 ng	10 ng
超純水	補(bǔ)到50μL	補(bǔ)到50μL

 注意：本試劑盒提供的dNTP混合物中，標(biāo)記底物與非標(biāo)記底物的比例已經(jīng)進(jìn)過優(yōu)化，如果自備標(biāo)記dUTP，其與dTTP的zuì佳比例需要優(yōu)化，標(biāo)記不同，比例不同。對DIG-11-dUTP，zuì佳比例1：3；對BrdUTP，zuì佳比例為1：1。
7. 按第5步的PCR參數(shù)進(jìn)行標(biāo)記PCR，但需要進(jìn)行下列修改：一是循環(huán)數(shù)增加到35-55個循環(huán)。由于模板為純化后的PCR產(chǎn)物，探針對擴(kuò)增長度完整性要求不高(長度不均的探針由于能形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，效果反而更好)，所以可以增加循環(huán)數(shù)；二是延伸時間增加15秒，因?yàn)闃?biāo)記dUTP參入到DNA的速度比常規(guī)的dTTP慢；三是降低復(fù)性溫度5-7℃，因?yàn)闃?biāo)記核苷酸參入到DNA后，新模板的Tm值將降低。
8. 標(biāo)記探針的定量：取標(biāo)記反應(yīng)和對照反應(yīng)的產(chǎn)物1-5μl，在瓊脂糖凝膠上跟濃度已知的DNA marker一起電泳，并判斷探針的濃度。由于標(biāo)記反應(yīng)的PCR產(chǎn)物中額外帶有非同位素的配體(生物素，dì高辛等)、因此其泳動速度將慢于非標(biāo)記PCR產(chǎn)物(但同位素標(biāo)記不能用此法)。
 注意：如果擴(kuò)增的是單鏈DNA探針，其結(jié)合EB的能力遠(yuǎn)低于雙鏈DNA(EB是嵌合到雙鏈堿基對之間的，而單鏈DNA沒有堿基對，只有一些局部區(qū)域折疊形成的有限雙鏈區(qū)，因此能結(jié)合的EB很少)，因此EB染色的強(qiáng)弱不能準(zhǔn)確反應(yīng)DNA的濃度，可以采用銀染定量(跟marker比較)。一般100ng模板按上述條件經(jīng)過單鏈PCR擴(kuò)增可得到700ng左右探針。
9. 剩余的PCR標(biāo)記產(chǎn)物可以不經(jīng)過純化，直接加入(對單鏈PCR探針)雜或加熱變性并急冷后加入(對雙鏈PCR探針)到雜交液中使用。如果暫時不用請放-20℃長期保存。如果需要純化，請使用乙酸銨/乙醇沉淀法。

本頁產(chǎn)品地址：http://www.lgsztm.com/sell/show-8527538.html