英文名稱:RT EasyTM（For first-strand cDNA synthesis）
產(chǎn)品規(guī)格:25 rxns 100 rxns
產(chǎn)品貨號(hào):RT-01011
保存說(shuō)明:短期室溫，長(zhǎng)期2-8℃
產(chǎn)品描述:用于長(zhǎng)cDNA合成或者客戶特定引物RT反應(yīng)
英文名稱:RT EasyTM（First-strand cDNA for Real Time PCR）
產(chǎn)品規(guī)格:50 rxns 200 rxns
產(chǎn)品貨號(hào):RT-01021
產(chǎn)品描述:第1鏈合成，添加2種引物，用于Real Time PCR
第1鏈cDNA合成試劑盒 注意事項(xiàng):
1、確保RNA完整性及純度。RNA質(zhì)量是決定合成cDNA第1鏈成功的關(guān)鍵因素,其純度及完整性可由OD260/OD280比值和進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。較純的RNA樣品OD260/OD280比值通常為1.8-2.0,若該比值偏低,應(yīng)進(jìn)一步純化。真核生物RNA樣品電泳圖譜28s和18s的比值約為2:1,否則,表明有RNA降解。
2、避免RNA酶污染。進(jìn)行cDNA合成所用的器皿、試劑和溶液必須完全無(wú)菌。操作過(guò)程始終戴手套以杜各種RNA酶的污染。
3、?合成cDNA第1鏈的引物選擇。選擇oligo(dT)12-18作為反轉(zhuǎn)錄引物,可保證cDNA具有完整的3’-端,通常可得到接近全長(zhǎng)的cDNA第1鏈;若選擇隨機(jī)寡核苷酸(dN)6或(dN)9作為引物,引物在整個(gè)mRNA的多個(gè)位點(diǎn)退火,產(chǎn)生短的部分長(zhǎng)度的cDNA第1鏈。這種方法經(jīng)常用于獲得5’末端序列及從帶有二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)域或帶有逆轉(zhuǎn)錄酶不能復(fù)制的終止位點(diǎn)的RNA模板獲得cDNA。
第1鏈cDNA合成試劑盒 操作方法:
1、?逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)?
(1)?在無(wú)菌薄壁管中加入以下成份:
Total?RNA 0.5-1.0?g
(dN)9?or?oligo(dT)18 100pmol
(2)?混勻后,70℃變性5min,將薄壁管迅速置于冰上冷卻,然后依次加入以下成份:
5×M-MLV?Buffer?????4?l
dNTPs(10mM?each)????1?l
RNasin????????10U
100mM?DTT???????2?l
M-MLV?Reverse?Trans
DEPC-treated?water????up?to?20?l
（3）?混勻后短暫離心，使用oligo(dT)18引物時(shí)在42℃，使用隨機(jī)引物(dN)9時(shí)在37℃下溫育1小時(shí)。
(4)?94℃?5min終止反應(yīng)后,冰上冷卻。
(5)?合成的cDNA第1鏈可直接用于PCR擴(kuò)增或進(jìn)行其它下游操作。
2、?PCR擴(kuò)增?
(1)?在PCR薄壁管中加入以下試劑
Synthesized?cDNA????2-5?l
10×PCR?Buffer?????2?l
Upper?primer?????10pmol
Lower?primer?????10pmol
dNTPs(10mM?each)????0.5?l
Taq?DNA?Polymerase????1.5U
ddH2O???????up?to?20?l
(2)?混勻后短暫離心,然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
94℃預(yù)變性2.5min。進(jìn)入下列30~40個(gè)循環(huán)(此擴(kuò)增條件僅供參考):94℃30s,60℃?45s,72℃?1min~3min。zui后72℃延伸7min。
第1鏈cDNA合成試劑盒 常見(jiàn)問(wèn)題及參考意見(jiàn)
1、cDNA產(chǎn)量很低,為什么?
可能的原因：
(1)RNA模板質(zhì)量低；
(2)對(duì)mRNA濃度估計(jì)過(guò)高；
(3)反應(yīng)體系中存在反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑或反轉(zhuǎn)錄酶量不足；
(4)反應(yīng)體積過(guò)大，一般不應(yīng)超過(guò)50?l。
2、合成不了長(zhǎng)鏈的cDNA,為什么?
(1)?RNA降解。對(duì)使用的器具、試劑用DEPC、干熱或濕熱滅菌處理，以杜RNase污染。同時(shí)，在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中加入RNase抑制劑。
(2)?反應(yīng)條件不合適。通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定zui合適的反應(yīng)條件，包括酶量、鹽濃度、反應(yīng)溫度（37~56℃）、DTT濃度（0.5~10mM）。
(3)?RNA結(jié)構(gòu)問(wèn)題。提高逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)溫度，或者使用隨機(jī)引物。
