軟骨RNA提取試劑盒說明書

產(chǎn)品編號：BTN70401

規(guī)格：50T

產(chǎn)品及特點：

本產(chǎn)品專門從各種軟骨組織樣品中快速提取總RNA的試劑盒，它能有效克服傳統(tǒng)TRIzol方法提取軟骨組織RNA時，十分容易產(chǎn)生糖蛋白和酸性多糖污染這一缺點。

1. 能有效去除糖蛋白、粘蛋白污染，OD260/280一般均在1.9以上。

2. RNA產(chǎn)率一般為5-15 μg/100 mg。

3. 操作簡單，整個提取過程一般只需要10多分鐘。

4. 得到的RNA可以直接用于RT-PCR、Northern雜交、mRNA純化、Primer Extension、RNA Protection、in vitro translation等研究。

規(guī)格及成分：

保存條件：

常溫運輸，4℃保存，有效期一年。

自備試劑：

氯fang、75%乙醇、RNase-free水。

使用方法：

1. 先將50-200 mg新鮮或冷凍的軟骨組織液氮研磨成粉，加入1 mL溶液A（使用前必須放在65℃水浴使沉淀徹底溶解）溶解，然后將研磨物轉(zhuǎn)移到新的1.5 mL離心管中, 振蕩混合30秒。也可以將軟骨組織剪碎后與溶液A一起勻漿，再轉(zhuǎn)移到離心管中。

2. 在裝有研磨物/勻漿物的離心管中加入0.3 mL的溶液B，振蕩器振蕩30秒混勻。注意：振蕩器振蕩時必須使管底溶液震蕩起來。

3. 加入0.2 mL自備氯fang，振蕩器振蕩30秒混勻。注意：振蕩器振蕩時必須使管底溶液震蕩起來。

4. 室溫12000-15000 g離心2-5分鐘。

5. 將上清液(約0.8 mL)轉(zhuǎn)移到另一干凈的1.5 mL塑料離心管中，下層有機相和中間層含有DNA、蛋白質(zhì)和其他雜質(zhì)，避免觸及或吸取。zui好留下100 μL上清液不取。

6. 在上清液中加入0.5 mL的溶液C，振蕩器振蕩30秒混勻。注意：振蕩器振蕩時必須使管底溶液震蕩起來。

7. 加入0.2 mL的自備氯fang，振蕩器振蕩30秒混勻。注意：振蕩器振蕩時必須使管底溶液震蕩起來。

8. 室溫12000-15000 g離心3分鐘，兩相間將有白色膜狀物(蛋白質(zhì))形成。

9. 將上清液(約1 mL)轉(zhuǎn)移到另一干凈的1.5 mL塑料離心管中，避免觸及或吸取有機相及其上面的白色膜狀物。

10. 在上清液中加入0.5倍體積的溶液D，振蕩器振蕩30秒混勻，此時溶液呈白色渾濁狀。注意：振蕩器振蕩時必須使管底溶液震蕩起來。

11. 室溫12000-15000 g離心5-10分鐘，RNA將在管底形成白色沉淀（約黃豆大小）。如果組織樣品量少或需要提高RNA回收率，也可以延長離心時間到20-30分鐘。

12. 在離心管中加入1mL 75%的乙醇，振蕩器上振蕩混勻30秒。

13. 室溫12000-15000 g離心5分鐘，RNA將在管底形成細小沉淀（約芝麻大?。?

14. 重復(fù)上步75%的乙醇洗滌一次，RNA將在管底形成細小沉淀。

15. 小心吸棄上清液，注意不要吸棄RNA沉淀。

16. 再短暫快速離心，用移液槍小心吸棄殘留液。注意：不要吸棄沉淀。此步將有效去除殘留的乙醇，否則后續(xù)反應(yīng)會受到影響。

17. 加入適量(一般為20-50 μL) RNase-free水使RNA沉淀溶解，存放于-80℃或立即使用。千萬不要用真空離心法使RNA沉淀過于干燥，否則RNA將變得十分難溶。

18. 檢測

a） RNA完整性的電泳檢測

如果需要做Northern雜交，強烈建議用戶使用甲醛變性膠進行RNA電泳，因為非變性膠不能分離所有的RNA分子（BioTechniques，28：414，2000）。如果是簡單檢測，可以使用TAE或百奧萊博的SuperBuffer-2 DNA/RNA兩用快速電泳液，但文獻報道必須使用變性上樣液（BioTechniques，9：558，1990）。普通DNA上樣液不含變性劑，也沒經(jīng)過去RNase處理，所以zui好不要使用。

尤其需要注意的是不要使用TBE進行RNA電泳，因為TBE所含硼酸是研究多糖的經(jīng)典方法----硼酸絡(luò)合法中的關(guān)鍵成分，硼酸通過與RNA核糖中的羥基發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)，形成RNA分子內(nèi)或RNA分子間的絡(luò)合復(fù)合物，使同樣長度的RNA具有不同的泳動速度，電泳條帶彌散，同時有大的RNA絡(luò)合復(fù)合物遲留在加樣孔中（一般會誤以為是基因組DNA污染）。RNA分子內(nèi)或RNA分子間的絡(luò)合物的形成的多少和比例又與硼酸與RNA的數(shù)量比例有關(guān)，而RNA樣品中污染的其他多糖也會參與此反應(yīng)，使硼酸對RNA電泳的影響更復(fù)雜，所以TBE對RNA電泳的影響沒有規(guī)律性和重復(fù)性。有的樣品可以使用有的又不行，zui好是避免使用。

由于動物細胞中70-80%的RNA為rRNA，后者又由28S (約4800 nt)，18S (約1900 nt)和5.8S (約120 nt)三種組成，所以變性膠電泳后應(yīng)該在UV下看見三條清晰的rRNA帶。由于核酸長度與結(jié)合EB的數(shù)量成正比（當然還與RNA的二級結(jié)構(gòu)有關(guān)，雙鏈部分結(jié)合能力比單鏈部分強），所以28S rRNA條帶的熒光強度一般比18S rRNA條帶的熒光強度強1.5-2.3倍。如果這兩條rRNA帶不清晰或比例小于此范圍則表示RNA有降解（因為大的RNA被酶降解的可能更大）。

b） RNA產(chǎn)量產(chǎn)率測定

將5-10 μL RNA溶于TE緩沖液中(pH7.5-8.2之間)檢測其在OD260的光吸收。通過光吸收可以得出RNA濃度（1 OD260的RNA=40 μg/mL），進而計算出RNA的產(chǎn)量（濃度X體積)和產(chǎn)率(RNA產(chǎn)量/組織用量)。

注意不要將RNA稀釋在DEPC水中檢測OD260和OD280，否則光吸收比在TE中測得的低10%-15%。

c） RNA純度測定

無污染的總RNA的OD260/OD280一般在1.8-2.1之間(具體數(shù)值與其堿基組成和溶液成分等多種因素有關(guān))，OD260/OD230一般在2.0-2.3之間，如果低于或高于此范圍則分別表示樣品可能有蛋白質(zhì)或多糖的污染，但一般不影響RT-PCR等反應(yīng)。蛋白質(zhì)污染可以通過酚/氯fang抽提一次然后酒精沉淀去除，DNA和多糖污染可以分別用百奧萊博的DNA Erasol 和PS Erasol去除。