cDNA一鏈合成試劑盒說明書

產品編號：BTN60906

規格：10T/50T

產品及特點：

本試劑盒提供合成cDNA 一鏈所需要的全部試劑。其原理是用突變的莫洛尼氏鼠白血病病毒反轉錄酶(M-MμLV RT)合成mRNA 的全長cDNA 拷貝。

1. 使用突變的反轉錄酶，內源RNase H 活性低。

2. zui長可合成13 Kb 的cDNA。

3.可以使用oligo-dT、隨機引物和RNA 專一性引物三種引物(前兩種本試劑盒提供)。

4.總RNA、poly(A)+RNA 或特殊RNA 均可作為模板。

5.可用于cDNA 文庫構建、RT-PCR、探針標記等。

規格及成分：

保存條件：

低溫運輸，-20℃保存，有效期一年。

使用方法：

一：合成PCR 用的1st-strand cDNA

1. 按下表配制RT 反應體系:

引物

2. 70℃保溫5分鐘后立即冰浴。

3. 再加入5 μL RT Buffer(含dNTP)。

4. 37℃保溫5分鐘。對富含二級結構的高GC RNA模板，可以改成45℃保溫5分鐘。如果使用隨機引物，則改成25℃ 5分鐘。

5. 加入2 μL MMLV 逆轉錄酶(含RI)，反應終體積為20 μL。

6. 42℃保溫60分鐘(但如果使用隨機引物，需要先25℃保溫10分鐘，然后再轉移到42℃保溫60分鐘)。此步為RT 反應。

7. 70℃保溫10分鐘以終止反應，然后放置在冰上待用。合成的cDNA可以直接作為PCR模板使用，不需要純化。

二：合成建文庫用的1st-strand cDNA

1. 按下表配制RT 反應體系:

2. 70℃保溫5分鐘后立即冰浴。

3. 再加入5 μL RT Buffer(含dNTP)。

4. 37℃保溫5分鐘。對富含二級結構的高GC RNA模板，可以改成45℃保溫5分鐘。如果使用隨機引物，則改成25℃ 5分鐘)。

5. 加入2 μL MMLV 逆轉錄酶(含RI)，反應終體積為20μL。

6. 42℃保溫60分鐘(但如果使用隨機引物，需要先25℃保溫10分鐘，然后再轉移到42℃保溫60分鐘)。此步為RT 反應。

7. 70℃保溫10分鐘以終止反應，放置在冰上待用。合成的cDNA可以用于第二鏈cDNA 的合成或放置在-20℃長期保存。

三：用對照模板合成cDNA

1. 按下表配制RT 反應體系:

2. 70℃保溫5分鐘后立即冰浴。

3. 再加入5 μL RT Buffer(含標記dNTP，本試劑不提供)。

4. 37℃保溫5分鐘。如果使用隨機引物，則保溫溫度只能是25℃。

5. 加入2 μL MMLV 逆轉錄酶(含RI)，反應終體積為20μL。

6. 42℃保溫60分鐘(但如果使用隨機引物，需要先25℃保溫10分鐘，然后再轉移到42℃保溫60分鐘)。

7. 加1μL 0.5M EDTA，放置在冰上待用。

8. 電泳檢測。合成的cDNA 的量一般有加入RNA 總量的50%以上，電泳一般能出現1.1Kb 的片段(如果使用隨機引物，將出現多個小片段)。