MMLV逆轉錄酶說明書
產品編號：BTN60905
規格：10000U/50000U
產品及特點：
該酶是突變型的MMLV 逆轉錄DNA 聚合酶，從表達Molo
1. 延伸性能好，可合成長達12.5 Kb 的fμLl-length cDNA。
2. zui佳反應溫度為42℃，但在50℃時仍然有活性，70℃10 分鐘能使其失活。
3. 能以Cy3-，Cy5-，rhodamine-， aminoallyl-，fluorescein 等標記的nucleotides 為底物。
4. 可用于first strand cDNA 合成，second strand cDNA 合成，DNA labeling，RNA primer extension 等。
5. 與PCR 兼容，RT 產物可以用于PCR 和real-time PCR。
6. 能被金屬螯合劑，無機磷酸，焦磷酸和多胺抑制。
7. 沒有RNase H 活性。
規格及成分：
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成分 |
10000U |
50000U |
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MMLV 逆轉錄酶 (200 U/μL) |
50μl |
50μl×5 |
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5×RT Buffer |
1ml |
1ml×5 |
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說明書 |
1份 |
1份 |
保存條件：
低溫運輸，-20℃保存，有限期一年。
使用方法：
一：合成PCR 用的1st-strand cDNA
1. 按下表配制RT 反應體系:
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RNA |
模板 |
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總RNA |
100-500 ng |
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或poly(A) mRNA |
10-500 ng |
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或專一的RNA |
0.01pg-500ng |
注意：RNA 樣品不能有基因組DNA污染。
引物
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Oligo (dT)18(0.5ug/μL) |
1 μL |
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或隨機引物(0.2ug/μL) |
1 μL |
|
或RNA 模板專一性引物 |
15-20pmol |
注意：隨機引物于RNA 模板的比例跟zui后得到的cDNA 的平均長度成反比。
RNase-free 水 補水到12 μL
2. 70℃保溫5 分鐘后立即冰浴。
3. 嚴格按下表順序加入各成分：
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5×RT Buffer |
4 μL |
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RNase Inhibitor (20U/μL) |
1 μL |
|
dNTP (10 mM each) |
2 μL |
4. 37℃保溫5 分鐘。對富含二級結構的高GC RNA 模板，可以改成45℃保溫5 分鐘。如果使用隨機引物，則保溫溫度只能是25℃（5 分鐘）。
5. 加入1 μL (=200 U) MMLV 逆轉錄酶，反應終體積為20μL。
6. 42℃保溫60 分鐘（但如果使用隨機引物，需要先25℃保溫10 分鐘，然后再轉移到42℃保溫60 分鐘）。
7. 70℃保溫10 分鐘以終止反應，放置在冰上待用。合成的cDNA 可以直接作為PCR 模板使用，不需要純化。
二：合成建文庫用的1st-strand cDNA
1. 按下表配制RT 反應體系:
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RNA |
模板 |
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或poly(A) mRNA |
1 ug |
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或專一的RNA |
0.5-1ug |
注意：RNA 樣品不能有基因組DNA污染。
引物
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Oligo (dT)18(0.5ug/μL) |
1 μL |
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或隨機引物(0.2ug/μL) |
1 μL |
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或RNA 模板專一性引物 |
100pmol |
注意：隨機引物于RNA模板的比例跟zui后得到的cDNA 的平均長度成反比。
RNase-free 水 補水到12 μL
2. 70℃保溫5 分鐘后立即冰浴。
3. 嚴格按下表順序加入各成分：
|
5×RT Buffer |
4 μL |
|
RNase Inhibitor (20U/μL) |
1 μL |
|
dNTP (10 mM each) |
2 μL |
4. 37℃保溫5 分鐘。對富含二級結構的高GC RNA 模板，可以改成45℃保溫5 分鐘。如果使用隨機引物，則保溫溫度只能是25℃（5 分鐘）。
5. 加入1 μL (=200 U) MMLV 逆轉錄酶，反應終體積為20μL。
6. 42℃保溫60 分鐘（但如果使用隨機引物，需要先25℃保溫10 分鐘，然后再轉移到42℃保溫60 分鐘）。
7. 70℃保溫10 分鐘以終止反應，放置在冰上待用。合成的cDNA 可以用于第二鏈cDNA 的合成或放置在-20℃。
