一站式RNA電泳套裝說明書

產(chǎn)品編號(hào)：BTN60904

規(guī)格：10T

產(chǎn)品及特點(diǎn)：

本產(chǎn)品是包括瓊脂糖、去離子甲醛、RNA 上樣液、電泳液等在內(nèi)的RNA電泳套裝，專門用于RNA 電泳分析。可以進(jìn)行至少10次mini 變性膠電泳。

1. 即開即用，用戶不需要自己進(jìn)行RNase 滅活、高壓滅菌、pH 調(diào)節(jié)等操作。

2. 與 Northern雜交等后續(xù)反應(yīng)兼容。。

規(guī)格及成分：

保存條件：

常溫運(yùn)輸和保存，但收到貨后RNAon 需要4℃保存，RNARUN，10×一旦打開需要-20℃保存，有效期一年。

自備試劑：

EB (10 mg/mL)、DEPC 水。

使用方法：

注意：所有器皿（三角瓶，電泳槽，槍頭等）均需去除RNase。強(qiáng)烈推薦使用本公司的的固相RNase 清除劑。

一、配制瓊脂糖甲醛變性膠（1.2%, 100 mL）

1. 在三角瓶中加入下列成份:

瓊脂糖 1.2-1.5g

DEPC水 87mL

2. 將瓊脂糖加熱融化后，加入10 mL 10×RNArun（10×RNArun 就是10×MOPS 緩沖液，其瓶子一旦打開，就很容易產(chǎn)生污染細(xì)菌，細(xì)菌大量繁殖后會(huì)釋放大量 RNase，所以剩下的10×RNArun zui好-20℃放置）。

3. 待膠冷卻至 60°C 左右，再加下列成份:

甲醛 3.0 mL

自備EB(10mg/mL) 2-4μL

注意：由于本試劑盒提供的RNAon 中含EB，所以也可以不加EB，但效果較差。如果使用自備的其他染料，如SYBR Green I，則不能同時(shí)使用其他染料，包括含EB 的RNAon，用戶需要另購不含EB 的RNAon）。

4. 混勻后倒膠, 凝固半小時(shí)后即可以使用。

二、配制電泳液

5. 將 RNArun 用DEPC 水稀釋十倍后即成電泳液，所需要的體積根據(jù)使用的電泳槽決定。

三、變性RNA 樣品

6. 在一干凈的離心管中將5-10 uL RNA 和15 uL RNAon 混合，50-60℃保溫10 分鐘后冰浴5-10 分鐘，直接上樣。注意：每一泳道至多可分析30 μg RNA，通常用10-20 μg 總RNA 進(jìn)行Northern 雜交，可以檢測(cè)高豐度mRNA（占mRNA 總量的0.1%以上）；如待測(cè)RNA 含量微，每個(gè)泳道需加0.5-3.0 μg poly(A)+ RNA。

四、電泳

7. 電泳時(shí)，將凝膠預(yù)電泳5 min（電壓為5 V/cm）。隨后加樣品和分子量對(duì)照(如果有的話)，以3－4 V/cm 的電壓電泳，直至染料遷移至膠下游的3/4 處。

8. 電泳結(jié)束后，在300 nm 紫外燈下拍照。

五、后續(xù)處理

9. 按標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行Northern 雜交等后續(xù)處理。

使用效果：

 

圖注: 用本產(chǎn)品電泳兔全血總RNA 效果圖。10 uL 總RNA與15 uL RNAON 混合后在甲醛瓊脂糖變性膠上電泳0.5小時(shí)，直接在紫外燈下觀察并照相。

疑難解答：

Q：RNA 電泳為何zui好使用RNARUN，不要使用DNA 電泳液TAE 或TBE？

A：一是因?yàn)镽NARUN 經(jīng)過去RNase 處理，而一般實(shí)驗(yàn)室使用的TAE 或TBE都沒有經(jīng)過去RNase 處理，故有可能含RNase，使樣品RNA 降解。即使要滅活TAE 或TBE 中的RNase 也十分麻煩，因?yàn)镈EPC 不能處理含Tirs 的緩沖液；二是TEB 含有硼酸，硼酸是研究多羥基醇和糖的經(jīng)典試劑，它能與RNA 中含多羥基的核糖反應(yīng)生成糖硼酸絡(luò)合物，故電泳時(shí)RNA 帶型十分彌散。在一定濃度范圍內(nèi)，RNA 分子間還能通過硼酸形成分子間復(fù)合物，出現(xiàn)電泳時(shí)各種RNA 以一條帶的形式出現(xiàn)的現(xiàn)象。所以RNA 電泳時(shí)要避免使用含硼酸的緩沖液。使用TAE 效果雖然比TBE 稍好，但文獻(xiàn)報(bào)道（BioTechniques 2000, 28:414-415），它不能分離某些大小不同的RNA 分子。

Q：上樣孔里的紅色熒光物一定是污染的基因組DNA 嗎？

A：不是。用TAE 或TBE 電泳液和非變性膠電泳RNA 時(shí)容易產(chǎn)生此現(xiàn)象，初步研究發(fā)現(xiàn)大部分紅色熒光物是變性不充分的單鏈RNA通過堿基互補(bǔ)或通過硼酸絡(luò)合（如果使用TBE 作電泳液的話）形成的復(fù)合物，加RNase 處理后，這些紅色熒光物一般會(huì)消失。為避免此現(xiàn)象，建議zui好使用甲醛變性膠電泳。如果需要使用非變性膠，也必須在上樣前使RNA 變性。

使用百奧萊博優(yōu)化的上樣/變性/染色三用溶液RNAON 可以使RNA 在非變性膠上電泳時(shí)也有較好分辨率。使用非變性膠時(shí)，可以使用TAE 或超快電泳液SuperBuffer-2，zui好不要使用TBE 緩沖液，因?yàn)門BE 中的硼酸能與RNA 的多羥基形成復(fù)合物，RNA 很難形成銳利的條帶。

Q：如何確認(rèn)和去處除污染的基因組DNA？

A：如果懷疑有DNA 污染，可以用RNase 處理RNA 樣品，然后再電泳。如果上樣孔里的紅色熒光物不消失，則表示是基因組DNA 污染。進(jìn)一步確認(rèn)可以使用PCR擴(kuò)增法。去除污染的DNA可以使用非酶的DNA去除劑DNAErasol 或RNase-free DNase，由于RNase-free DNase 一般都有殘留的RNase 污染，所以必須嚴(yán)格按照廠家提供的使用手冊(cè)進(jìn)行操作。

Q：為何我的植物RNA 樣品有4-5 條帶？

A：部分植物組織有葉綠體等質(zhì)體，而葉綠體有核糖體，所以也有其rRNA。

葉綠體的rRNA 跟細(xì)胞漿里面核糖體的rRNA 大小不同，所以一般會(huì)多出兩條帶（共4 條rRNA 條帶）。小的tRNA 和5S rRNA 有時(shí)可見，有時(shí)不可見，取決于回收效率。