土壤DNA提取試劑盒說明書
產品編號：BTN60701
規格：50T
產品及特點：
由于土壤中有機質含量豐富,尤其是其中的腐殖酸對PCR等后續反應有大的抑制作用,所以從土壤微生物提取高純度的DNA一直是十分棘手的問題。本產品是百奧萊博精心優化的專門用于從各種土壤樣品和河海沉積物中提取高質量的DNA的試劑。
1. 去污染效guo好，OD260/280一般都在1.8以上, OD260/340一般都在3.0以上(表示腐殖酸少),得到的DNA樣品原液或稀釋液可以直接用于PCR等后續反應。
2. 產量高，每克土壤一般可以提取到5 ug 左右DNA，片段長度在30 Kb左右。
3. 操作過程簡單快速，只需要30分鐘。
4. 擴容性好，既可以在1.5 mL離心管中微量提取，也可以在50 mL離心管中進行大規模制備。
5. 試劑無害, 環保。
規格及成分：
|
成分 |
規格 |
|
溶液A |
25ml |
|
溶液B |
25ml |
|
說明書 |
1份 |
保存條件：
常溫運輸及保存，有效期一年。
自備試劑：
氯fang、無水乙醇、75%乙醇。
使用方法：
1. 65℃預熱溶液A，待其沉淀溶化后，充分混勻，取0.5 mL加入到1.5 mL塑料離心管中并放置于65℃待用。
2. 稱取0.1-0.3 g的土壤，加入到含預熱溶液A的離心管中，震蕩器上劇烈震蕩5-10分鐘。如果是擴量操作，可以使用更多土壤和較大離心管。也可以將同一種土壤在較大離心管中震蕩處理，然后再分到1.5 mL離心管中。注意:不論使用大的還是小的離心管，一定要讓管底的土壤震蕩起來。
3. 將離心管置于65℃水浴中保溫至少5分鐘。
4. 13000-15000 g室溫離心3分鐘，將上清轉移到一新離心管中(上清液一般呈淡黃色或深棕色，具體取決于腐殖酸的含量，上清的體積一般為300-400μL)。
5. 在上清液中加入等體積的溶液B，上下顛倒30秒充分混勻，溶液將呈白色或淡黃色混濁狀。
6. 將離心管冰浴至少5分鐘。
7. 13000-15000 g室溫離心3分鐘，轉移上清到新的1.5 mL離心管中，上清液顏色將比第4步得到的上清的顏色稍淡，體積在0.7 mL左右。
1. 65℃預熱溶液A，待其沉淀溶化后，充分混勻，取0.5 mL加入到1.5 mL塑料離心管中并放置于65℃待用。
2. 稱取0.1-0.3 g的土壤，加入到含預熱溶液A的離心管中，震蕩器上劇烈震蕩5-10分鐘。如果是擴量操作，可以使用更多土壤和較大離心管。也可以將同一種土壤在較大離心管中震蕩處理，然后再分到1.5 mL離心管中。注意:不論使用大的還是小的離心管，一定要讓管底的土壤震蕩起來。
3. 將離心管置于65℃水浴中保溫至少5分鐘。
4. 13000-15000 g室溫離心3分鐘，將上清轉移到一新離心管中(上清液一般呈淡黃色或深棕色，具體取決于腐殖酸的含量，上清的體積一般為300-400 μL)。
5. 在上清液中加入等體積的溶液B，上下顛倒30秒充分混勻，溶液將呈白色或淡黃色混濁狀。
6. 將離心管冰浴至少5分鐘。
7. 13000-15000 g室溫離心3分鐘，轉移上清到新的1.5 mL離心管中，上清液顏色將比第4步得到的上清的顏色稍淡，體積在0.7 mL左右。
8. 加入0.2 mL的氯fang(自備)，震蕩器上充分振蕩30秒混勻。注意:一定要讓管底的溶液震蕩起來。
9. 13000-15000 g室溫離心3分鐘，小心轉移上清到新離心管中。說明：離心后兩相交界面將有白色膜狀物，其中有機相部分顏色較深，一般呈淡棕色。上清的顏色取決于土壤中腐殖酸的含量。
10. 重復第8步和第9步一次。zui后將上清轉移到新的1.5 mL離心管時，不要超過0.5 mL，否則沒有空間加兩倍體積的乙醇。如果有多余的可以棄之不用。
11. 加入2倍體積的乙醇(自備)，上下顛倒30秒混勻，15000 g離心5分鐘,棄上清，管底將有微小DNA沉淀，有時候呈棕色。注意：不要用異丙醇代替乙醇，否則腐殖酸更容易于DNA共沉淀。
12. 加入1mL 75%乙醇，震蕩，13000-15000 g室溫離心3分鐘，棄上清。
13. 重復上步清洗一次。注意：75%乙醇洗兩次有助于去除部分腐殖酸。
14. 短暫離心，吸棄殘留的75%乙醇（約50μL），室溫晾干。注意：一定要去除殘留的75%乙醇，否則會影響后續反應和電泳上樣（樣品會飄走）。
15. 加入30 μL TE緩沖液溶解沉淀。注意：不知道樣品土壤DNA產率前zui好不要加過多TE，如果DNA濃度高，可以再加TE稀釋。
16. DNA即可用于電泳、酶切和PCR等反應。 電泳時zui好采取電泳后染色，因為實驗發現，殘留腐殖酸會吸附走大量的EB，使在腐殖酸后面的DNA不能染色。
備注：
有用戶反映提淤泥的DNA時，將步驟2中的劇烈震蕩5-10分鐘改成混勻3分鐘，步驟3中的65℃水浴中保溫時間延長到10分鐘，再重復8步，9步一次，可以得到完整清晰明亮DNA條帶。
疑難解答：
Q: 如何判斷提取的ＤＮＡ沒有腐植酸污染？
A：方法一是目測法，即看得到的溶液是否無色。如果呈淡棕黑色或淡黃色，說明可能是少量殘留的未除盡的腐植酸。方法二是檢測zui大光吸收。注意：有腐植酸污染并不表示DNA不能使用，有的腐殖酸并不抑制PCR擴增。
Q: 腐殖酸的zui大吸收波長是多少？
A：腐植酸（humic acid）是一大類呈棕黑色或黑色的物質,其結構千差萬別，土壤中腐殖酸的組成和特點隨土壤不同而不同，所以其zui大吸收波長也各不相同，有的土壤的腐殖酸在260 nm有zui大吸收（見Appl.Environ. Microbiol., 63：4993, 1997），有的則在340 nm。所以用特定的波長測定OD值時波長的選定要根據土壤而決定。Sigma, Fluke等公司出售的腐植酸產品成分一般比較簡單，其zui大吸收波長不能推廣到成分更為復雜的土壤腐殖酸樣品。
Q:本產品是否徹底去除土壤DNA中的所有腐植酸?
A: 腐植酸（humic acid）是動、植物的殘骸經過微生物的分解、轉化和成千上萬年的復雜化學反應而產生的特性各異的一大類物質，其含量和種類隨土壤不同而不同。本產品可以從大部分土壤樣品中提取到無腐殖酸污染的DNA。但對于腐殖酸含量特別高的土壤樣品（如泥碳樣品，含70%腐殖酸），可能還需要使用柱式腐殖酸清除劑（BTN60801）以便清除DNA樣品中殘留的腐殖酸。
Q: 是否腐植酸都會抑制后續的DNA反應？
A：否，因為腐植酸是一大類物質的統稱，他們的結構和特性各不相同，所以是否對后續反應有影響zui好通過實驗來驗證。如果用提取的DNA溶液原液進行反應而反應沒發生，而對照樣品（已知的不含污染的DNA）能夠發生，說明可能抑制作用。
Q：如果樣品含有抑制后續反應的腐植酸，如何去除？
A：如果提取的DNA原液不能擴增，可以將樣品稀釋10倍和100倍再進行PCR，抑制作用一般可以解除。如果仍然抑制，可以使用我公司的PCR Inhibitor Erasol（BTN60804）。如果仍然不能解除，則可以通過柱式腐殖酸清除劑（BTN60801）或先電泳，再用片段膠回收試劑Magic Gel DNABACK（BTN60706）純化土壤DNA，去除殘留抑制劑。其中后兩方法zui有效，得到的原液一般可以直接擴增。
Q：在用土壤DNA進行細菌專一性PCR時，為何沒加DNA模版的陰性對照有擴增產物出現？
A：這是由于使用的Taq DNA聚合酶一般從E.coli表達菌株中提取，提取過程中污染了E.coli的基因組DNA，而使用的廣譜細菌專一性引物可以識別所有細菌DNA基因組DNA模版，所以會產生擴增。建議使用高質量的Taq DNA聚合酶。
