細菌RNA提取試劑盒說明書
產品編號：BTN51102
規格：100T/250T
產品及特點：
本產品是在動物RNA提取試劑盒基礎上根據細菌提取的具體情況改良而得。它基于異硫氰酸胍/酚/氯fang提取RNA原理，可用于包括E.coli、Campylobacter fetus、Pseudomo
1. 操作簡單快速，只要十分鐘左右,可以全在室溫下進行。
2. 所得 RNA 質量高,OD260/OD280 一般在 1.9，不含基因 DNA 污染。
3. 靈敏度高，可以從一個菌落中提取到普通電泳能夠檢測到的總 RNA。
4. 高于進口同類產品。
規格及成分：
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成分 |
100T |
250T |
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細菌RNA提取試劑 |
100ml |
250ml |
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說明書 |
1份 |
1份 |
保存條件：
常溫運輸，4℃保存，有效期一年。
自備試劑：
氯fang，異丙醇，75%乙醇，RNA 溶解液。
使用方法：
1. 在 1.5 mL 塑料離心管中離心收集 0.2-1.5 mL 新鮮細菌(注意:由于細菌RNA 半衰期十分短，所以，必須使用zui新鮮細菌)，吸盡液體培養基，加入1 mL細菌 RNA提取試劑盒并用槍充分吹打，確保細菌全部裂解，沒有塊狀物。
如果使用菌落，則用接種環小心將其轉移到裝有1mL 細菌 RNAOUT 的1.5 m 塑料離心管中，用移液槍吹打均勻。在細菌數較少時，建議使 用助沉劑 RNADOWN 以提高 RNA 回收率。
2. 加入 0.2 mL 氯fang，在振蕩器上充分振蕩混均 30 秒（必須將管底的液體振蕩起來，否則不能有效將 DNA 打斷和去除蛋白質）。
3. 12000-15000g室溫離心3分鐘。上清液無色，下層液呈籃色，中間為蛋白質。小心將上清液轉移到另一干凈 1.5ml塑料離心管中，上清液體積約為0.6mL。為避免觸及中間層的 DNA 和蛋白質，建議分小量多次 吸取，并且只取 0.5 mL，留 0.1 mL 左右。當細菌數量較少時，中間層十分松散，上清時很容易吸到下層有機相，需要更加小心。
4. 在上清液中加入等體積的異丙醇，振蕩器上振蕩混均 30秒。
5. 12000-15000 室溫離心 3-10 分鐘，RNA 將在管底側面形成沉淀。
6. 小心吸棄上清液，注意不要吸棄 RNA 沉淀。
7. 在離心管中加入 1mL 75%乙醇，振蕩器上振蕩混均 30 秒。
8. 12000-15000 g 室溫離心 1 分鐘。
9. 小心吸棄上清液，注意不要吸棄 RNA 沉淀。
10. 重復第 8 到第 10 步一次。
11. 短暫快速離心，用移液槍小心吸棄殘留液（約 50 μL）。
12. 短暫放 1-2 分鐘后加入適量 RNA 溶解液使 RNA 沉淀溶解，可以立即使用或存放于-80℃長期保存。
13. RNA 完整性的電泳檢測：
如果需要做 Northern 雜交，強烈建議用戶使用甲醛變性膠進行RNA電泳，因為非變性膠不能分離所有的RNA 分子（BioTechniques，28：414，2000）。如果是簡單檢測，可以使用TAE或百奧萊博的SuperBuffer-2 DNA/RNA 兩用快速電泳液，但文獻報道必須使用變性上樣液（BioTechniques，9：558，1990）。普通 DNA 上樣液不含變性劑，也沒經過去 RNase 處理，所以zui好不要使用。 尤其需要注意的是不要使用TBE 進行RNA 電泳，因為TBE 所含硼酸是研究多糖的經典方法----硼酸絡合法中的關鍵成分，硼酸通過與RNA 核糖中的羥基發生絡合反應，形成RNA 分子內或RNA 分子間的絡合復合物，使同樣長度的RNA 具有不同的泳動速度，電泳條帶彌散，同時有大的RNA 絡合復合物遲留在加樣孔中（一般會誤以為是基因組DNA 污染）。RNA 分子內或RNA 分子間的絡合物的形成的多少和比例又與硼酸與RNA的數量比例有關，而RNA 樣品中污染的其他多糖（如植物中提取的RNA）也會參與此反應，使硼酸對RNA 電泳的影響更復雜，所以TBE 對RNA 電泳的影響沒有規律性和重復性。有的樣品可以使用有的又不行，zui好是避免使用。
由于細菌細胞中70-80%的RNA為rRNA，后者又由23S (約 3700nt)，16S (約1700 nt)和5S (約100 nt)三種組成，所以變性膠電泳后應該在UV下看見三條清晰的rRNA帶。由于核酸長度與結合 EB 的數量成正比（當然還與RNA 的二級結構有關，雙鏈部分結合能力比單鏈部分強），所以23S rRNA條帶的熒光強度一般比16S rRNA條帶的熒光強度強2倍。如果這兩條rRNA 帶不清晰或比例小于此范圍則表示 RNA 有降解（因為大的 RNA 被酶降解的可能更大）。
14. RNA 產量產率測定：
將 5-10 μL RNA 溶于 TE 緩沖液中(pH7.5-8.2 之間)檢測其在OD260 的光吸收。通過光吸收可以得出 RNA 濃度（1 OD260 的RNA=40 μg/mL），進而計算出 RNA 的產量和產率。注意不要將 RNA 稀釋在 DEPC 水中檢測 OD260 和 OD280，否則光吸收比在 TE 中測得的低 10%-15%，因為核酸光吸收跟溶液 pH 相關，而 DEPC 水中的DEPC 高壓分解后產生的 CO2 與水反應生成碳酸，使溶液 pH 降低進而降低 RNA 的光吸收。
15. RNA 純度測定：
無污染的總 RNA 的 OD260/OD280一般在 1.8-2.1 之間(具體數值與其堿基組成和溶液成分等多種因素有關)， OD260/OD230 一般在2.0-2.3 之間，如果低于或高于此范圍則分別表示樣品可能有蛋白質或多糖的污染，但一般不影響 RT-PCR 等反應。蛋白質污染可以通過酚/氯fang抽提一次然后酒精沉淀去除，DNA 和多糖污染可以分別用百奧萊博的DNAErasol和 PS Erasol去除。
疑難解答：
Q：上樣孔里的紅色熒光物一定是污染的基因組DNA嗎？
A：不是。用 TAE 或 TBE 電泳液和非變性膠電泳 RNA 時容易產生此現象，百奧萊博初步研究發現大部分紅色熒光物是變性不充分的單鏈RNA 通過堿基互補或通過硼酸絡合（如果使用TBE作電泳液的話）形成的復合物，加 RNase處理后，這些紅色熒光物一般會消失。為避免此現象，建議zui好使用甲醛變性膠電泳。如果需要使用非變性膠，也必須在上樣前使RNA變性。使用我司基因優化的上樣/變性/染色三用溶液 RNAON 可以使 RNA 在非變性膠上電泳時也有較好分辨率。使用非變性膠時，可以使用TAE或超快電泳液SuperBuffer-2，zui好不要使用TBE緩沖液，因為TBE中的硼酸能與RNA的多羥基形成復合物，RNA 很難形成銳利的條帶。
Q：如何確認和去處除污染的基因組 DNA？
A：如果懷疑有 DNA 污染，可以用 RNase 處理 RNA 樣品，然后再電泳。如果上樣孔里的紅色熒光物不消失，則表示是基因組 DNA 污染。進一步確認可以使用 PCR 擴增法。去除污染的 DNA 可以使用非酶的 DNA 去除劑DNA Erasol 或 RNase-free DNase，由于 RNase-free DNase 一般都有殘留的RNase 污染，所以必須嚴格按照廠家提供的使用說明書進行操作。
