常態轉化液說明書

產品編號：BTN51101

規格：20T

產品及特點：

常態轉化液能使各種常態的E.coli 細胞直接用于快速轉化實驗,使廣大用戶不再因為簡單的轉化實驗而再為感受態細胞的制備,保存和運輸等繁瑣的事情而操心，大大地縮短了基因克隆實驗的時間,提高使用者的工作效率。

1. 不需專門制備感受態細胞,直接使用常態的細胞進行質粒轉化,隨用隨配,十分方便。

2. 常態細胞包括新鮮培養的菌液,新鮮的或4℃放置數月的培養基菌落,甘油菌種保存液等。

3. 適用菌種和質粒廣泛,用過的E.coli 菌種包括K12 系的DH5a 和Tg1, B 系的BL21(DE3)。用過的質粒有pGEM, pET 和克必隆系列等。

4. 轉化效率適中，使用10ng 質粒轉化一般能得到上萬個轉化子）效率在10E5 到10E6 CFU/ug 質粒之間）,使用3-5μL 連接液轉化一般能得幾千個轉化子,足夠篩選重組子使用(但不適合構建文庫)。

5. 單管快速操作，整個操作可以在一個1.5 mL 塑料離心管中進行, zui短可以在三十分鐘內完成, 不需要過夜細菌培養,熱休克處理甚至恒溫搖床,其適用于自動化的大規模克隆篩選工作。

6. 穩定性好，本可以在-20℃條件下長期保存而不用擔心轉化效率的降低,而感受態細胞在同樣條件下會迅速失去活性。

格及成分：

保存條件：

低溫運輸，-20℃保存，有效期一年。

自備試劑：

液體培養基本（LB或SOC），抗菌素。

使用方法：

1. 標記無菌的1.5 mL塑料離心管并加入1 mL 液體培養基（如SOC或LB），每次轉化試驗zui好加上陽性對照（用提供的pGEM3或其他質粒）和陰性對照（不加DNA）各一個。

2. 如果使用E.coli菌落,則直接用接種環,無菌牙簽或無菌吸頭從培養皿上挑取1-5個菌落(直徑在3-5 mm之間)到每個離心管中，用移液槍輕柔吹打散開。如果使用甘油菌種保存液,則直接取50-100 μL菌種液到1 mL培養液中。如果使用單個菌落培養得到的新鮮培養液，則取1 mL培養了3-4小時的菌液直接從第4步開始。

3. 37℃保溫1小時(如果保溫時間延長到3-4小時，可以提高轉化效率一倍，但過長則轉化效率又開始降低)。

4. 室溫10000 rpm離心1分鐘后小心移棄上清(液體培養基)，離心速度低于10000rpm則細菌沉淀易丟失。沉淀的細菌約芝麻或麥片大小為宜。細胞過多或過少都不好。

5. 短暫離心，用移液槍小心將殘留的培養液(約50 μL)吸出，否則殘留培養基將會嚴重影響轉化效率，故此步不能省略。

6. 加入50 μL 冰浴的克必隆轉化液并小心將細胞吹打均勻。

7. 加DNA樣品。在樣品管中加入1-5 μL連接反應液并輕柔吹打均勻；在陽性對照管中加入5 ng陽性質粒(沒被酶切的載體，也可以使用常用的pGEM, pUC, pBR322等質粒)；在陰性對照管中加入連接反應的陰性對照，如果沒有則不加入任何溶液或加入1-5 μL無菌水。

8. 將上述離心管置于-20℃直到液體凝固為止（一般需要20分鐘到1小時），然后冰浴放置5-10分鐘。

9. 在每個離心管中加入1 mL無抗菌素的SOC或LB培養液，混勻后置37℃水浴保溫1小時以便讓抗性基因表達,否則將沒有轉化子生長。

10. 將溶液充分吹打混勻后分別取30-200 μL分別涂于含相關的抗菌素的培養盤上，剩余溶液zui好留4℃待用。

11. 37℃ 16-24小時培養，陰性對照盤上不應有任何落菌，否則可以判斷操作中有污染或培養基中抗菌素濃度不夠。使用質粒轉化的陽性對照100 μL涂盤一般能有上千個菌落。連接樣品轉化所得菌落數將取決于連接反應效率等多種因素，100 μL的涂盤一般有幾十到幾百個轉化子。

使用效果：

左圖是用10 ng克必隆G 載體轉化10個E.coli Tg1菌落后得到的轉化子。右圖是用3μL連接液(克必隆B載體+1 Kb DNA片段,10μL反應體系)轉化10個E.coli DE3菌落后37℃過夜保溫得到的轉化子。涂盤量均為200μL。