血液RNA提取試劑盒說明書

產品編號：BTN3071

規格：50T/250T

產品及特點：

本產品是專門從全血樣品中快速提取總RNA的試劑盒，主要用于提取全血細胞的總RNA(提取血漿病毒RNA 需使用病毒RNAout，提取純化后的白細胞RNA 可使用動物RNA提取試劑盒)。

1. RNA 無明顯降解和DNA 污染， OD260/280 均在1.9 以上。血液RNA

的產量與動物種類和動物的狀態(如有疾病與否)有很大關系，人全血產量為2-6 μg/mL，兔全血產量為5-10 μg/mL。

2. 操作簡單，直接使用新鮮的或冷凍的抗凝全血樣品，不需裂解紅細胞等任何預處理步驟，整個提取過程只需要十多分鐘，可以全在室溫下進行。

3. 處理量大，每管的樣品處理量可以達到1.5 mL，高于進口的同類產品。

4. 與常用的抗凝劑(包括肝素，EDTA，檸檬酸鈉，草酸鈉)兼容，得到的RNA可以直接用于RT-PCR 和Northern 雜交等研究。

規格及成分：

保存條件：

常溫運輸，4℃保存，溶液B 和溶液C 有腐蝕性。4℃保存的溶液A 可能會產生白色沉淀，用前需65℃水浴加熱直到沉淀溶解。有效期一年。

自備試劑：

氯fang，異丙醇，75%乙醇，RNA 溶解液（如液相RNase 清除劑）。

使用方法：

1. 將 0.2-1.5 mL 新鮮或解凍后的抗凝全血加入到1.5 mL 塑料離心管中，15000 g 室溫離心3 分鐘，棄上清(血漿)。如果此時血液細胞沉淀體積大于0.2 mL， 則需要減少血液的使用量，具體減少量需根據具體情況決定，因為各個個體(尤其是患者)血液中白細胞數目差別很大。如果提取0.1 mL 以下的微量血液樣品zui好加入百奧萊博的微量助沉劑RNADOWN。

2. 將 1 mL 溶液A 加入到血液細胞沉淀中，用移液槍吹打沉淀使細胞裂解。

3. 將 0.3 mL 的溶液B 和0.2 mL 氯fang加入離心管，劇烈震蕩30 秒。

4. 13000-15000 g 室溫離心5分鐘，將上清液(為無色或淺紅色，約0.5-0.9

mL)轉移到另一干凈離心管中。為防止污染，zui好留100 μL 左右的上清液。下層有機相一般呈深紅色，中間層為白色，含有DNA，蛋白質和其他細胞破碎物，避免觸及或吸取。

5. 加入 0.5 mL 的溶液C 和0.2 mL 的氯fang到上清液中，用手上下劇烈搖晃30 秒。

6. 13000-15000 g 室溫離心3 分鐘，將上清液(無色，約1 mL)轉移到另一干凈離心管中，避免觸及或吸取有機相及其上面的白色膜狀物(蛋白質)。可以按每次吸取100-200 μL 的方式分批轉移。

7. 在上清液中加入1/2 體積的溶液D，用手上下劇烈搖晃30 秒，溶液將呈白色渾濁狀。

8. 13000-15000 g 室溫離心5-30 分鐘，小心移棄上清液，避免觸及管底大量的白色RNA 沉淀。

9. 在離心管中加入1 mL 75%乙醇，振蕩器上振蕩混均30 秒。室溫離心13000-15000 g 1分鐘，RNA 此時在管底形成細小沉淀。小心吸棄上清液，注意不要吸棄RNA 沉淀。

10. 重復第9 步的75%乙醇清洗步驟一次。

11. 短暫快速離心數秒使管壁上殘留液體沉到管底（約50 μL），用移液槍小心吸棄，注意不要吸棄沉淀。此步十分重要，因為殘留的乙醇會影響后續反應。

12. 室溫短暫放置2 分鐘，立即加入適量(一般為10-30 μL)溶解液使RNA沉淀溶解。建議使用具有滅活殘留RNase 功能的RNA 溶解液液相RNase Erasol 而不要使用經典的DEPC 水。千萬不要用真空離心法使RNA 沉淀過于干燥，否則RNA將變得十分難溶。RNA 樣品可以直接使用，也可以存放于-80℃長期保存。

疑難解答：

1．有的樣品在第4 步離心后有很厚的中間層，上清很少。原因是蛋白質變

性不充分，可以適當減少血液的用量。白細胞多的血液容易產生這種情況。

2．有的樣品在加入溶液D 離心后，沉淀上浮在液面，這是由于液體的比重大于沉淀，可以加入少量的超純水使溶液的比重降低，直到沉淀能下去為止。也可能把下層的有機相取上來了，如果這樣需要重做。

3．千萬不要用真空離心法使RNA 沉淀過于干燥，否則將變得十分難溶。

4．無論使用甲醛變性膠還是非變性膠電泳時，一定要使用RNA 變性/上樣液（如百奧萊博的RNAON）以讓RNA 充分變性，否則加樣孔中會有RNA復合物（人們會誤以為是DNA污染）。使用沒有變性能力的DNA 上樣液不能使RNA 復合物分離。

5．測OD時一定要使用pH 8.0 的緩沖液（如TE），不要使用微酸性的DEPC水，否則OD 值會比真實的值低15-20%。