1、 試劑盒簡(jiǎn)介 
貨號(hào)：HB-701-1 
鯉春病毒血癥（SVC），又名鯉春病毒病，是一種由彈狀病毒引起的主要感染四大家魚(yú)和幾種鯉
科魚(yú)的病毒性傳染病。主要危害鯉，但也可感染草魚(yú)、鰱、鳙、鯽和六須鲇等。鯉是其中敏感的
宿主，又以 1 齡以上的鯉危害為嚴(yán)重。該病主要流行于春季，水溫在 13-20℃時(shí)流行。本病的主
要病癥是魚(yú)群聚集于出水口處，體色發(fā)黑，呼吸緩慢，病魚(yú)往往失去平衡而側(cè)游，有瘀斑性出血，
皮膚及鰓上多見(jiàn)。
為了適應(yīng)鯉春病（SVC）病毒快速檢測(cè)和疫病研究的需要，本公司參照中華人民共和國(guó)出入境檢
驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《鯉春病毒血癥檢疫技術(shù)規(guī)范》(SN/T 1152-2011)中規(guī)定的引物和探針序列，經(jīng)多
次實(shí)驗(yàn)及系統(tǒng)優(yōu)化，開(kāi)發(fā)生產(chǎn)了本試劑盒。應(yīng)用本試劑盒進(jìn)行檢測(cè)具有快速、靈敏、特異、準(zhǔn)確、
安全操作簡(jiǎn)單、應(yīng)用廣泛和高通量檢測(cè)等特點(diǎn)及優(yōu)點(diǎn)。
2、 試劑盒組成 
試劑盒組成包括核酸擴(kuò)增試劑。具體組成參見(jiàn)表 1：
表 1：試劑盒組成（50test/盒）
試劑盒組成成分 體積 
核酸提取試劑： 核酸裂解液 15ml×2 管
核酸擴(kuò)增試劑： DEPC 水
SVCV 熒光 RT-PCR 反應(yīng)液
酶混合物
陰性對(duì)照
SVCV 熒光陽(yáng)性對(duì)照
1ml×1 管
750μL×1 管
60μL×1 管
1ml×1 管
1ml×1 管
（注：核酸提取試劑可使用本公司生產(chǎn)的提取核酸更快捷方便的《病毒 RNA 柱式提取試劑盒》） 
3、 樣本采集,存放及運(yùn)輸 
3.1 樣本采集：所用取樣器材必須經(jīng)高壓滅菌并烘干。
取新鮮魚(yú)類(lèi)組織臟器（肝、腦、脾、腎）2g 于已洗凈、滅菌并烘干的研缽中充分研磨，加 5ml PBS
混勻，2 000r/min 離心 10min 取上清轉(zhuǎn)入無(wú)菌離心管中備用。或取有可疑細(xì)胞病變的細(xì)胞懸液用于
檢測(cè)。
3.2 存放：研磨后的樣本在 2 ℃—8 ℃條件下保存應(yīng)不超過(guò) 24 h；-70 ℃以下可長(zhǎng)期保存，但應(yīng)避
免反復(fù)凍融（多凍融 3 次）。
3.3 運(yùn)輸：采用冰壺或泡沫箱加冰密封進(jìn)行運(yùn)輸。
4、 熒光 RT-PCR 檢測(cè) 
4.1 操作方法 
4.1.1 樣本的處理（在樣本制備區(qū)進(jìn)行）：
4.1.1.1 取 n 個(gè)滅菌的 1.5 mL Eppendorf 管，其中 n 為被檢樣品、陽(yáng)性對(duì)照與陰性對(duì)照的和（陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照在試劑盒中已標(biāo)出），做標(biāo)記。
4.1.1.2 每管加入 600 ?L 裂解液，分別加入被檢樣本、陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照各 200 ?L，一份樣本換用一個(gè)吸頭混勻器上振蕩混勻 5 s（不能過(guò)于強(qiáng)烈，以免產(chǎn)生乳化層，也可以用手顛倒混勻），于 4℃ 12 000 r/min 離心 15 min。
4.1.1.3 取與 4.1.1.1 相同數(shù)量滅菌的 1.5 mL Eppendorf 管，加入 500 ?L 異丙醇（-20℃預(yù)冷），
做標(biāo)記。吸取 4.1.1.2 各管中的上清液轉(zhuǎn)移至相應(yīng)的管中，上清液應(yīng)至少吸取 500?L，不能吸出中間層，顛倒混勻。
4.1.1.4 于 4 ℃、12 000 r/min 離心 15 min（Eppendorf 管開(kāi)口保持朝離心機(jī)轉(zhuǎn)軸方向放置），小心倒去上清，倒置于吸水紙上，沾干液體(不同樣品須在吸水紙不同地方沾干)；加入 600 ?L 75％
乙醇，顛倒洗滌。
4.1.1.5 于 4 ℃、12 000 r/min 離心 10 min（Eppendorf 管開(kāi)口保持朝離心機(jī)轉(zhuǎn)軸方向放置），小心倒去上清，倒置于吸水紙上，盡量沾干液體（不同樣品須在吸水紙不同地方沾干）。
4.1.1.6 4 000 r/min 離心 10s（Eppendorf 管開(kāi)口保持朝離心機(jī)轉(zhuǎn)軸方向放置），將管壁上的殘余液體甩到管底部，小心倒去上清，用微量加樣器將其吸干，一份樣本換用一個(gè)吸頭，吸頭不要碰到有沉淀一面，室溫干燥 3 min，不能過(guò)于干燥，以免 RNA 不溶。
4.1.1.7 加入 33 ?L DEPC 水，輕輕混勻，溶解管壁上的 RNA，2 000 r/min 離心 5 s，冰上保存?zhèn)溆谩Ｌ崛〉?RNA 須在 2 h 內(nèi)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增；若需長(zhǎng)期保存須放置-70 ℃冰箱內(nèi)。
【也可參照《病毒 RNA 柱式提取試劑盒說(shuō)明書(shū)》（貨號(hào)：HB-QPCR-01）使用，更方便快捷提取核酸】。
注：提取的 RNA 須在 2 h 內(nèi)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增；若需長(zhǎng)期保存須放置-70 ℃冰箱內(nèi)。 
4.1.2 檢測(cè)
4.1.2.1 擴(kuò)增試劑準(zhǔn)備（在反應(yīng)混合物配制區(qū)進(jìn)行）：
從試劑盒中取出相應(yīng)的熒光 RT-PCR 反應(yīng)液、酶混合物，在室溫下融化后，2000 r/min 離心 5 s。
設(shè)所需熒光 RT-PCR 檢測(cè)總數(shù)為 n，其中 n 為被檢樣品、陽(yáng)性對(duì)照與陰性對(duì)照的和，每個(gè)樣品測(cè)試反應(yīng)體系配制見(jiàn)表 2：
表 2 每個(gè)樣品測(cè)試反應(yīng)體系配制表
試劑 RT-PCR 反應(yīng)液 酶混合物
用量 15 μL 1.0 μL
根據(jù)測(cè)試樣品的數(shù)量計(jì)算好各試劑的使用量，加入到適當(dāng)體積試管中，充分混合均勻，向每個(gè)熒光RT-PCR管中各分裝15?L，轉(zhuǎn)移至樣本處理區(qū)。
4.1.2.2 加樣（樣本處理區(qū)進(jìn)行）：
在各設(shè)定的熒光RT-PCR管中分別加入上述樣本處理步驟4.1.1.7中制備的RNA溶液各10 ?L，蓋緊管蓋，500 r/min離心30 s。
4.1.2.3 熒光 RT-PCR 檢測(cè)（在檢測(cè)區(qū)進(jìn)行）：
將4.1.2.2中離心后的PCR管放入熒光RT-PCR檢測(cè)儀內(nèi)，記錄樣本擺放順序。
循環(huán)條件設(shè)置：
一階段，反轉(zhuǎn)錄42 oC /30 min；
第二階段，預(yù)變性92 oC/3 min；
第三階段，92 oC/15s，60 oC/30s，40個(gè)循環(huán)，在第三階段每次循環(huán)的60 oC退火延伸時(shí)收集熒光。
試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)束后，根據(jù)收集的熒光曲線和Ct值判定結(jié)果。