人褪黑素(MT)ELISA快速檢測試劑盒
使用說明書
廈門慧嘉生物科技有限公司
本試劑盒僅供研究使用
檢測范圍：25 ng/ml-400 ng/ml
zui低檢測限：12.5 ng/ml
特異性：本試劑盒可檢測人MT，且與其他相關物質無交叉反應。
有效期：6個月
預期應用：ELISA法定量測定人血清、血漿或其它相關生物液體中MT含量。
說明
1．試劑盒保存：-20℃（較長時間不用時）；2-8℃（頻繁使用時）。
2．濃洗滌液低溫保存會有鹽析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶。
3．中、英文說明書可能會有不一致之處，請以英文說明書為準。
4．剛開啟的酶聯板孔中可能會含有少許水樣物質，此為正常現象，不會對實驗結果造成任何影響。
實驗原理
本試劑盒采用酶聯免疫直接競爭法檢測MT。微孔板上包被有抗體MT抗體。加入MT標準品或樣品，然后加入生物素標記的MT。樣品中的MT、生物素標記MT與固相板上的抗MT抗體發生競爭結合。再向微孔中加辣根過氧化物酶標記的親和素，形成固相抗體-生物素化MT-親和素-HRP復合物。經加底物顯色后，隨著樣品中MT濃度的升高，顯色OD值呈逐漸下降的線性關系。
試劑盒組成及試劑配制
1. 酶聯板(Assay plate )：一塊（96孔）。
2. 標準品（Standard）：5×1ml/瓶。
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標準品 |
S1 |
S2 |
S3 |
S4 |
S5 |
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濃度 （ng/ml） |
25 |
50 |
100 |
200 |
400 |
3. 生物素標記MT：1×6ml/瓶。
4. 辣根過氧化物酶標記親和素（HRP-Avidin ）：1×6ml/瓶。
5. 底物溶液A（Substrate A）：1×6ml/瓶。
6. 底物溶液B（Substrate B）：1×6ml/瓶。
7. 濃洗滌液（Wash Buffer）：1×15ml/瓶，使用時每瓶用蒸餾水稀釋20倍。
8. 終止液（Stop Solution）：1×6ml/瓶（2N H2SO4）。
需要而未提供的試劑和器材
1. 標準規格酶標儀
2. 高速離心機
3. 電熱恒溫培養箱
4. 超聲清洗器
5. 干凈的試管和Eppendof管
6. 系列可調節移液器及吸頭，一次檢測樣品較多時，用多通道移液器
7. 蒸餾水，容量瓶等
標本的稀釋原則：
先通過文獻檢索的方式了解待測樣本的大致含量，確定適當的稀釋倍數。只有稀釋至標準曲線的范圍內，檢測的結果才是準確的。稀釋的過程中，應做好詳細的記錄。后計算濃度時，稀釋了“N”倍，標本的濃度應再乘以“N”。
濃洗滌液稀釋原則：
臨用前用蒸餾水進行20倍稀釋。如有鹽析出，稀釋后水浴加溫助溶。
操作步驟
實驗開始前，請提前配置好所有試劑，試劑或樣品稀釋時，均需混勻，混勻時盡量避免起泡。每次檢測都應該做標準曲線。如樣品濃度過高時，行稀釋，以使樣品符合試劑盒的檢測范圍。
1. 加樣：分別設空白孔、標準孔、待測樣品孔。空白孔不加任何溶液，余孔分別加標準品或待測樣品50ul，注意不要有氣泡，加樣將樣品加于酶標板孔底部，然后在所有孔中加入50 ul 生物素標記MT（空白孔中不加）。盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。酶標板加上蓋或覆膜，37℃反應60分鐘（為保證實驗結果有效性，每次實驗請使用新的標準品溶液）。
2. 溫育后，棄去孔內液體，甩干，洗板3-5次，每次浸泡10秒，約200ul/每孔，甩干。
3. 所有孔中加入50 ul辣根過氧化物酶標記親和素。盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。酶標板加上蓋或覆膜，37℃反應30分鐘
4. 按步驟2進行洗滌。
5. 依序每孔加底物溶液A和B各50ul，37℃避光顯色（30分鐘內，一般10-15分鐘內，此時肉眼可見標準品的后3-4孔有明顯的梯度藍色，前3-4孔顏色不明顯，即可終止）。
6. 依序每孔加終止溶液50ul，終止反應（此時藍色立轉黃色）。終止液的加入順序應盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實驗結果的準確性，底物反應時間到后應盡快加入終止液。
7. 用酶聯儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）。 在加終止液后15分鐘以內進行檢測。
注：
1. 用戶在初次使用試劑盒時，應將各種試劑管離心數分鐘，以便試劑集中到管底。
2. 每次實驗留一孔作為空白調零孔，該孔不加任何試劑，只是后加底物溶液及2N H2SO4。測量時先用此孔調OD值至零。
3. 為防止樣品蒸發，試驗時將反應板放于鋪有濕布的密閉盒內，酶標板加上蓋或覆膜。
4. 未使用完的酶標板或者試劑，請于2-8℃保存。
5. 建議檢測樣品時均設雙孔測定，以保證檢測結果的準確性。
洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標板內的液體；在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標板朝下用力拍幾次；將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml注入孔內，浸泡1-2分鐘。根據需要，重復此過程數次。
自動洗板：如果有自動洗板機，應在熟練使用后再用到正式實驗過程中。
計算
以標準物的濃度為橫坐標（對數坐標），OD值為縱坐標（普通坐標），在半對數坐標紙上繪出標準曲線，根據樣品的OD值由標準曲線查出相應的濃度；再乘以稀釋倍數；或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數，即為樣品的實際濃度。
注意事項
1. 當混合蛋白溶液時應盡量輕緩，避免起泡。
2. 洗滌過程非常重要，不充分的洗滌易造成假陽性。
3. 一次加樣時間控制在5分鐘內，如標本數量多，推薦使用排槍加樣。
4. 請每次測定的同時做標準曲線，做復孔。
5. 如標本中待測物質含量過高，請先稀釋后再測定，計算時請后乘以稀釋倍數。
6. 底物請避光保存。
7. 不要用其它生產廠家的試劑替換試劑盒中的試劑。
t-famil5%? ????dЯco:p>操作步驟
1. 標準品的稀釋與加樣：在酶標包被板上設標準品孔10孔，在一、第二孔中分別加標準品100μl，然后在一、第二孔中加標準品稀釋液50μl，混勻；然后從一孔、第二孔中各取100μl分別加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分別加標準品稀釋液50μl，混勻；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl棄掉，再各取50μl分別加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分別加標準品稀釋液50ul，混勻；混勻后從第五、第六孔中各取50μl分別加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分別加標準品稀釋液50μl，混勻后從第七、第八孔中分別取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分別加標準品稀釋液50μl，混勻后從第九第十孔中各取50μl棄掉。（稀釋后各孔加樣量都為50μl，濃度分別為360 ng/L，240 ng/L ，120 ng/L，60 ng/L， 30 ng/L）。
2. 加樣：分別設空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）、待測樣品孔。在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測樣品10μl（樣品終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。
3. 溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。
4. 配液：將30（48T的20倍）倍濃縮洗滌液用蒸餾水30（48T的20倍）倍稀釋后備用。
5. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復5次，拍干。
6. 加酶：每孔加入酶標試劑50μl，空白孔除外。
7. 溫育：操作同3。
8. 洗滌：操作同5。
9. 顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘.
10. 終止：每孔加終止液50μl，終止反應（此時藍色立轉黃色）。
11. 測定：以空白空調零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。 測定應在加終止液后15分鐘以內進行。
注意事項：
1． 試劑盒從冷藏環境中取出應在室溫平衡15-30分鐘后方可使用，酶標包被板開封后如未用完，板條應裝入密封袋中保存。
2． 濃洗滌液可能會有結晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結果。
3． 各步加樣均應使用加樣器，并經常校對其準確性，以避免試驗誤差。一次加樣時間控制在5分鐘內，如標本數量多，推薦使用排槍加樣。
4． 請每次測定的同時做標準曲線，做復孔。如標本中待測物質含量過高（樣本OD值大于標準品孔一孔的OD值），請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數（n倍）后再測定，計算時請后乘以總稀釋倍數（×n×5）。
5． 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。
6． 底物請避光保存。
7． 嚴格按照說明書的操作進行，試驗結果判定必須以酶標儀讀數為準.
8． 所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應按傳染物處理。
9． 本試劑不同批號組分不得混用。
10. 如與英文說明書有異，以英文說明書為準。
計算：
以標準物的濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，
在坐標紙上繪出標準曲線，根據樣品的OD
值由標準曲線查出相應的濃度；再乘以稀釋
倍數；或用標準物的濃度與OD值計算出標
準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值
代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋
倍數，即為樣品的實際濃度。
試劑盒性能：
1.樣品線性回歸與預期濃度相關系數R值為0.95以上。
2.批內與批間應分別小于9%和11%
檢測范圍：
62.5 pg/ml-4000 pg/ml
靈敏度：
15.6 pg/ml
保存條件及有效期：
1.試劑盒保存：；2-8℃。
2．有效期：6個月
