One-Step IHC Assay( DAB,compatible for Rabbit & Mouse)
產品貨號：KFS029
儲存條件：4℃ for 12 months, protected from light
For Research Only
一、試劑盒說明
試劑盒可用于免疫組織化學方法以顯示抗原的分布。適用于常規福爾馬林固定石蠟包埋切片、冰凍切片、培養固定的細胞涂片，以及新鮮制備的血涂片等。即用型一步法免疫組化檢測試劑盒與常規免疫組化染色試劑盒相比，具有高靈敏性、高特異性及操作簡便的優點。多個HRP聚合物直接與二抗相連，大大放大了抗原抗體結合的信號，減少了孵育步驟，孵育時間縮短為10分鐘。試劑盒不含有生物素，完全避免了內源性生物素造成的背景影響。試劑盒提供的DAB顯色試劑為增強型顯色試劑，且自帶稀釋液，避免了由于水質的不同對DAB顯色造成的影響；與一般DAB試劑相比，增強型的穩定性顯著提高，顯色更醒目，敏感性更高。
二、試劑盒組份
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組份 |
KFS028（60 片） |
KFS029（300 片） |
保存條件 |
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試劑A：10%山羊血清封閉液 |
3 ml |
15 ml |
2-8℃ |
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試劑B：HRP 聚合物(即用型) |
3 ml |
15 ml |
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試劑C：增強劑 |
3ml |
15ml |
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試劑D：20 倍濃縮DAB 底物緩沖液 |
160 μl |
800μl |
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試劑E：20 倍濃縮DAB 顯色液 |
160 μl |
800μl |
2-8℃，避光保存 |
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試劑F：20 倍濃縮底物溶液 |
160 μl |
800μl |
2-8℃ |
三、試劑盒以外自備儀器和試劑
二甲苯、乙醇、無水甲醇、蒸餾水或去離子水、30％ H2O2、10 mM PBS（pH 7.4）、一抗（兔或鼠來源一抗抗體）、蘇木素染液、封片膠、顯微鏡。
四、使用注意事項
1. 檢測標本時需同時做陰性對照和陽性對照。
2. DAB 是一潛在致癌物，使用時請注意自我防護。
3. DAB 顯色液需現用現配，避光放置，且在30 分鐘內染色。
4. 用滴瓶加液時，每一滴的體積為50μL。
五、推薦操作方法（以石蠟切片為例）
1. 標本制備
石蠟切片用二甲苯常規脫蠟、入水、抗原修復（可根據一抗說明書推薦方法進行操作）。染色前用PBS 浸泡組織或細胞涂片10 分鐘。
（注意：從此步驟起，嚴禁標本或組織切片干燥）
2. 染色
1) 石蠟切片放入3％H2O2-甲醇液中浸泡10 分鐘，以消除內源性過氧化氫酶的作用。用
PBS 洗3 次，每次2min。
2) 加一滴試劑A于組織切片上（需完全覆蓋待檢組織）孵育30 分鐘。倒掉或吸干液體（不要沖洗）。
3) 每張切片加二滴（100μL）或適量一抗（需完全覆蓋待檢組織），濕盒內室溫孵育
30～60 分鐘或4℃過夜。建議參見每種抗體的說明書。PBS 洗3 次，每次2min。
4) 每張切片加一滴試劑B（需完全覆蓋待檢組織），孵育30 分鐘。用PBS洗3 次，每次2min。
5) 每張切片加一滴試劑C（需完全覆蓋待檢組織），孵育30 分鐘。用PBS洗3 次，每次2min。
6) 制備DAB顯色液（需現用現配；可根據需要一次染多張切片）
以染一張切片為例：①取2.5μL試劑D加入到50μL蒸餾水中，混勻。②取2.5μL試劑E、2.5μL試劑F加入①中，混勻。（避光放置，30min 內使用）。
7) 每張切片加一滴上述DAB 顯色液，室溫顯色2～5分鐘（可在鏡下掌握顯色程度）。
8) 自來水沖洗2min；蘇木素復染；如有必要，可用0.1%HCl-酒精分化，自來水沖洗，PBS(或氨水)返藍。
9) 切片經梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固。
六、結果：陽性結果為在抗原定位處染棕黃或棕褐色。
七、可能出現的問題及解決辦法
1. 脫蠟不徹底，容易出現非特異性背景染色，建議免疫組化切片脫蠟與常規HE 脫蠟分開。
2. 操作過程中沖洗不充分，容易出現非特異性背景染色，需嚴格控制沖洗時間與次數。
3. 為防止可能出現的假陽性、假陰性結果，建議在實驗過程設置陽性與陰性對照。
4. 操作中滴加試劑時緩沖液PBS 未瀝干致使試劑稀釋，將引起染色強度變弱或假陰性發
生。因此，每步滴加試劑前應將組織片上的 PBS 液除干，但又必須預防干片。
