One-Step IHC Assay( DAB,compatible for Rabbit & Mouse)
產(chǎn)品貨號(hào)：KFS028
儲(chǔ)存條件：4℃ for 12 months, protected from light
For Research Only
一、試劑盒說(shuō)明
試劑盒可用于免疫組織化學(xué)方法以顯示抗原的分布。適用于常規(guī)福爾馬林固定石蠟包埋切片、冰凍切片、培養(yǎng)固定的細(xì)胞涂片，以及新鮮制備的血涂片等。即用型一步法免疫組化檢測(cè)試劑盒與常規(guī)免疫組化染色試劑盒相比，具有高靈敏性、高特異性及操作簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)。多個(gè)HRP聚合物直接與二抗相連，大大放大了抗原抗體結(jié)合的信號(hào)，減少了孵育步驟，孵育時(shí)間縮短為10分鐘。試劑盒不含有生物素，完全避免了內(nèi)源性生物素造成的背景影響。試劑盒提供的DAB顯色試劑為增強(qiáng)型顯色試劑，且自帶稀釋液，避免了由于水質(zhì)的不同對(duì)DAB顯色造成的影響；與一般DAB試劑相比，增強(qiáng)型的穩(wěn)定性顯著提高，顯色更醒目，敏感性更高。
二、試劑盒組份
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組份 |
KFS028（60 片） |
KFS028（300 片） |
保存條件 |
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試劑A：10%山羊血清封閉液 |
3 ml |
15 ml |
2-8℃ |
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試劑B：HRP 聚合物(即用型) |
3 ml |
15 ml |
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試劑C：增強(qiáng)劑 |
3ml |
15ml |
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試劑D：20 倍濃縮DAB 底物緩沖液 |
160 μl |
800μl |
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試劑E：20 倍濃縮DAB 顯色液 |
160 μl |
800μl |
2-8℃，避光保存 |
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試劑F：20 倍濃縮底物溶液 |
160 μl |
800μl |
2-8℃ |
三、試劑盒以外自備儀器和試劑
二甲苯、乙醇、無(wú)水甲醇、蒸餾水或去離子水、30％ H2O2、10 mM PBS（pH 7.4）、一抗（兔或鼠來(lái)源一抗抗體）、蘇木素染液、封片膠、顯微鏡。
四、使用注意事項(xiàng)
1. 檢測(cè)標(biāo)本時(shí)需同時(shí)做陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照。
2. DAB 是一潛在致癌物，使用時(shí)請(qǐng)注意自我防護(hù)。
3. DAB 顯色液需現(xiàn)用現(xiàn)配，避光放置，且在30 分鐘內(nèi)染色。
4. 用滴瓶加液時(shí)，每一滴的體積為50μL。
五、推薦操作方法（以石蠟切片為例）
1. 標(biāo)本制備
石蠟切片用二甲苯常規(guī)脫蠟、入水、抗原修復(fù)（可根據(jù)一抗說(shuō)明書推薦方法進(jìn)行操作）。染色前用PBS 浸泡組織或細(xì)胞涂片10 分鐘。
（注意：從此步驟起，嚴(yán)禁標(biāo)本或組織切片干燥）
2. 染色
1) 石蠟切片放入3％H2O2-甲醇液中浸泡10 分鐘，以消除內(nèi)源性過(guò)氧化氫酶的作用。用
PBS 洗3 次，每次2min。
2) 加一滴試劑A于組織切片上（需完全覆蓋待檢組織）孵育30 分鐘。倒掉或吸干液體（不要沖洗）。
3) 每張切片加二滴（100μL）或適量一抗（需完全覆蓋待檢組織），濕盒內(nèi)室溫孵育
30～60 分鐘或4℃過(guò)夜。建議參見(jiàn)每種抗體的說(shuō)明書。PBS 洗3 次，每次2min。
4) 每張切片加一滴試劑B（需完全覆蓋待檢組織），孵育30 分鐘。用PBS洗3 次，每次2min。
5) 每張切片加一滴試劑C（需完全覆蓋待檢組織），孵育30 分鐘。用PBS洗3 次，每次2min。
6) 制備DAB顯色液（需現(xiàn)用現(xiàn)配；可根據(jù)需要一次染多張切片）
以染一張切片為例：①取2.5μL試劑D加入到50μL蒸餾水中，混勻。②取2.5μL試劑E、2.5μL試劑F加入①中，混勻。（避光放置，30min 內(nèi)使用）。
7) 每張切片加一滴上述DAB 顯色液，室溫顯色2～5分鐘（可在鏡下掌握顯色程度）。
8) 自來(lái)水沖洗2min；蘇木素復(fù)染；如有必要，可用0.1%HCl-酒精分化，自來(lái)水沖洗，PBS(或氨水)返藍(lán)。
9) 切片經(jīng)梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封固。
六、結(jié)果：陽(yáng)性結(jié)果為在抗原定位處染棕黃或棕褐色。
七、可能出現(xiàn)的問(wèn)題及解決辦法
1. 脫蠟不徹底，容易出現(xiàn)非特異性背景染色，建議免疫組化切片脫蠟與常規(guī)HE 脫蠟分開(kāi)。
2. 操作過(guò)程中沖洗不充分，容易出現(xiàn)非特異性背景染色，需嚴(yán)格控制沖洗時(shí)間與次數(shù)。
3. 為防止可能出現(xiàn)的假陽(yáng)性、假陰性結(jié)果，建議在實(shí)驗(yàn)過(guò)程設(shè)置陽(yáng)性與陰性對(duì)照。
4. 操作中滴加試劑時(shí)緩沖液PBS 未瀝干致使試劑稀釋，將引起染色強(qiáng)度變?nèi)趸蚣訇幮园l(fā)
生。因此，每步滴加試劑前應(yīng)將組織片上的 PBS 液除干，但又必須預(yù)防干片。
