冷凍保藏法適用于抗凍力強的微生物。這些微生物可在其菌體細胞外遭受凍結的情況下而不受損傷，而對其它大多數微生物而言，無論在細胞外凍結還是在細胞內凍結，都會對菌體造成損傷，當采用這種保藏方法時，應注意以下幾點：
1、原則上應盡快進行冷凍處理，但當加入保護劑時，可靜置一段時間后再進行處理。
2、就動物細胞而言，應在-20℃范圍內以1℃/min左右的速度緩慢降溫，此后必須盡快降到貯藏溫度；而對大多數微生物而言，則不必如此，如結構較為復雜的原蟲則可在-35℃范圍內進行緩慢降溫，而噬菌體則必需采用上述的二階段法進行冷凍。
3、要選擇適于冷凍干燥的菌齡細胞。
4、要選擇適宜的培養基，因為某些微生物對冷凍的抵抗力，常隨培養基成分的變化而顯示出巨大差異。
5、要選擇合適的菌液濃度，通常菌液濃度越高，生存率越高，保存期也越長。
6、若進行長期保存，則貯藏溫度越低越好。
7、取用冷凍保存的菌種時，應采取速融措施，即在35～40℃溫水中輕輕振蕩使之迅速融解。而就厭氧菌來說，則應選擇靜置融化的措施。當冷凍菌融化后，應盡量避免再次冷凍，否則菌體的存活率將顯著下降。
8、菌液內不添加電解質(如食鹽等)。
9、可在菌液內添加甘油等保護劑，以防止在冷凍過程中出現菌體大量死亡的現象。同樣，也可添加各種糖類、去纖維血液和脫脂牛乳等具有良好保護效果的溶劑，但對有些微生物而言，不加保護劑時更有效。