細胞計數

實驗原理：當待測細胞懸液中細胞均勻分布時，通過測定一定體積懸液中的細胞的數目，即可換算出每毫升細胞懸液中細胞的細胞數目。

具體操作：

一.準備工作：    

    取一瓶傳代的細胞，按照《傳代細胞培養（消化法）》中的傳代方法繁殖細胞，待長成單層后以被使用。

二.細胞懸液制備：

細胞懸液的制備方法是用0.25％的胰蛋白酶液消化、PBS液洗滌后，加入培養液（或Hanks液或PBS等平衡鹽溶液），吹打制成待測細胞懸液。

三.細胞計數：

1.蓋好蓋玻片：取一套血球計數板，將特制的蓋玻片蓋在血球計數槽上。

   2.制備計數用的細胞懸液：用吸管吸5滴細胞懸液到一離心管中，加入5滴臺盼藍染液（0.4％）或苯胺黑，活細胞不會被染色，加入染液后就可以在顯微鏡下區別活細胞和死細胞。

   3.將細胞懸液滴入計數板：將待測細胞懸液吹均勻，然后吸取少量懸液沿蓋片邊緣緩緩滴入，要保證蓋片下充滿懸液，注意蓋片下不要有氣泡，也不能讓懸液流入旁邊槽中。

   4.統計四個大格的細胞數：將血球計數板放于顯微鏡的低倍鏡下觀察，并移動計數板，當看到鏡中出現計數方格后，數出四角的四個大鉻（每個大格含有16個中鉻）中沒有被染液染上色的細胞數目。

   5.計算原細胞懸液的細胞數:按照下面公式計算細胞密度：

（細胞懸液的細胞數）/ml＝          （  四個大格子細胞數/4)         ×2×104 

說明：公式中除以4因為計數了4個大格的細胞數。

公式中乘以2因為細胞懸液于染液是1：1稀釋。

公式中乘以104因為計數板中每一個大格的體積為：

1.0mm（長）×1.0mm（寬）×0.1mm（高）＝0.1mm3 而 1ml＝1000mm3

四.細胞計數要點：

   1.進行細胞計數時，要求懸液中細胞數目不低于104個/ml，如果細胞數目很少要進行離心再懸浮于少量培養液中；

   2.要求細胞懸液中的細胞分散良好，否則影響計數準確性。

   3.取樣計數前，應充分混勻細胞懸液，尤其時多次取樣計數時更要注意每次取樣都要混勻，以求計數準確；

   4. 數細胞的原則是只數完整的細胞，若細胞聚集成團時，只按照一個細胞計算。如果細胞壓在格線上時，則只計上線，不計下線，只計右線，不計左線。

   5. 操作時，注意蓋片下不能有氣泡，也不能讓懸液流入旁邊槽中，否則要重新計數。

五.初學者易犯的錯誤：

   1. 計數前未將待測懸液吹打均勻。

   2. 滴入細胞懸液時蓋玻片下出現氣泡。

   3. 滴入懸液時的量太多，至使細胞懸液流入旁邊的槽中。

六.本實驗特殊試劑的配制：

4％臺盼藍母液：稱取4克臺盼藍，加入少量蒸餾水研磨，加雙蒸水至100毫升，用濾紙過濾，4℃保存。

使用液：使用時，用PBS稀釋母液至0.4％即可。