WB試驗(yàn)中常用細(xì)胞裂解液及酶抑制劑介紹

  1、細(xì)胞裂解液

  細(xì)胞裂解液作用：

  (1) 利用去污劑破壞脂質(zhì)雙分子層，破裂細(xì)胞;

  (2) 溶解蛋白;

  (3) 蛋白變性使其穩(wěn)定;

  (4) 抑制蛋白酶活性。

  細(xì)胞裂解成分一般使用的是表面活性劑，常用的有曲拉通X-100(Triton X-100)、脫氧膽(deoxycholate)、乙基苯基聚乙二醇(Nonidet P40，NP-40)、十二烷基磺酸鈉(SDS)。其中Triton X-100和NP-40為非離子型，deoxycholate和SDS為離子型。不同裂解成分的裂解強(qiáng)度不同，一般來(lái)說(shuō)Triton X-100和SDS的裂解能力較強(qiáng)，deoxycholate和NP-40的裂解效果較為溫和，可以根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)需求選用不同的裂解液。

  2、蛋白酶抑制劑

  破碎細(xì)胞提取蛋白質(zhì)的同時(shí)可釋放出蛋白酶，這些蛋白酶需要迅速的被抑制以保持蛋白質(zhì)不被降解。在蛋白質(zhì)提取過(guò)程中，需要加入蛋白酶抑制劑以防止蛋白水解。蛋白酶抑制劑(protease inhibitor)從廣義上指與蛋白酶分子活性中心上的一些基團(tuán)結(jié)合，使蛋白酶活力下降，甚至消失，但不使酶蛋白變性的物質(zhì)。各種蛋白酶對(duì)不同蛋白質(zhì)的敏感性各不相同，因此需要調(diào)整各種蛋白酶的濃度。由于蛋白酶抑制劑在液體中的溶解度極低，尤其應(yīng)注意在緩沖液中加入蛋白酶抑制劑時(shí)應(yīng)充分混勻以減少蛋白酶抑制劑的沉淀。

  常用的蛋白酶抑制劑和各自作用特點(diǎn)如下：

  (1) 苯甲酰磺酰氟(PMSF)：抑制絲氨酸蛋白酶(如胰凝乳蛋白酶，胰蛋白酶，凝血酶)和巰基蛋白酶(如木瓜蛋白酶);

  (2) 乙二胺四乙酸(EDTA)：作為螯合劑可逆抑制金屬蛋白水解酶;

  (3) 胃蛋白酶抑制劑(pepstantin)：抑制酸性蛋白酶如胃蛋白酶，血管緊張肽原酶，組織蛋白酶D和凝乳酶;

  (4) 亮抑蛋白酶肽(leupeptin)：可逆抑制絲氨酸、半胱氨酸蛋白酶和巰基蛋白酶，如木瓜蛋白酶，血漿酶和組織蛋白酶B;

  (5) 胰蛋白酶抑制劑(aprotinin)：競(jìng)爭(zhēng)性可逆抑制絲氨酸蛋白酶，如血漿酶，血管舒緩素，胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶;

  (6) AEBSF：一種水溶性的絲氨酸蛋白酶不可逆抑制劑，其抑制常數(shù)與PMSF和DFP的抑制常數(shù)相似，可以有效抑制胰蛋白酶(trypsin)、糜蛋白酶(chymotrypsin)、纖溶酶(plasmin)、激肽釋放酶(kallikrein)和凝血酶(thrombin)等蛋白酶，作為PMSF和DFP的替代物，AEBSF的毒性低、水溶性和水溶液穩(wěn)定性好。

  (7) 烏苯美司(I Ubenimex，NN，也稱為bestatin)：競(jìng)爭(zhēng)性，可逆的氨基肽酶抑制劑，對(duì)精氨酰氨基肽酶(氨基肽酶B)，白三烯A4水解酶(顯示環(huán)氧化物水解酶和氨基肽酶活性的鋅金屬蛋白酶)，丙氨酰氨基肽酶(氨肽酶M /N)，亮氨酰/胱氨酰氨基肽酶(催產(chǎn)素/血管加壓素酶)(白三烯D4水解酶)有抑制作用;

  (8) N-(反式-環(huán)氧丁二酰基)-L-亮氨酸-4-胍基丁基酰胺(E64)：半胱氨酸蛋白酶不可逆抑制劑;

  (9) 胃酶抑素A(Pepstatin A)：天冬氨酸蛋白酶可逆抑制劑。

  3、磷酸酶抑制劑

  細(xì)胞或組織裂解時(shí)會(huì)釋放出大量?jī)?nèi)源性蛋白磷酸酶，以各種方式催化磷酸化蛋白的去磷酸化，從而影響后續(xù)的蛋白檢測(cè)。因此在提取物中適量添加外源性磷酸酶抑制劑，有利于在之后的Western blotting、免疫共沉淀檢測(cè)磷酸化蛋白質(zhì)和蛋白激酶活性測(cè)定等實(shí)驗(yàn)過(guò)程中抑制磷酸化蛋白的去磷酸化，維持蛋白質(zhì)的磷酸化狀態(tài)。

  常見(jiàn)的磷酸酶有蛋白酪氨酸磷酸酶、堿性磷酸酶和酸性磷酸酶，常用的磷酸酶抑制劑如下：

  (1) 氟化鈉(sodiμm fluoride)：酸性磷酸酶可逆抑制劑;

  (2) 焦磷酸鈉(sodiμm pyrophosphate)：絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶不可逆抑制劑;

  (3) β-甘油磷酸(β-glycerophosphate)：絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶可逆抑制劑;

  (4) 正釩酸鈉(sodiμm orthovanadate)：堿性磷酸酶和酪氨酸磷酸酶可逆抑制劑：

  (5) 鉬酸鈉(sodiμm molybdate)：酸性磷酸酶不可逆抑制劑;

  (6) 二水酒石酸鈉(sodiμm tartrate dihydrate)：酸性磷酸酶可逆抑制劑;

  (7) 咪唑(imidazole)：堿性磷酸酶可逆抑制劑。

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