本產(chǎn)品是應(yīng)用新型的水溶性四唑鹽2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑單鈉鹽快速高靈敏度檢測細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性的比色檢測產(chǎn)品。...

產(chǎn)品特點(diǎn)：

● 使用方便：僅使用單一試劑；

● 靈敏度高，數(shù)據(jù)可靠，重現(xiàn)性好，線性范圍更寬；

● 結(jié)果穩(wěn)定：試劑本身穩(wěn)定性高，實(shí)驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定可靠；

● 無需放射性同位素和有機(jī)溶劑，對(duì)細(xì)胞毒性低；

● 適合于高通量藥物篩選。

試劑盒以外自備試劑和儀器：

● 帶有450nm濾光片的酶標(biāo)儀 ● CO₂培養(yǎng)箱 ● 96孔培養(yǎng)板 ● PBS ● 純水 ● 移液器

注意事項(xiàng)：

● 旋帽離心管裝的試劑在開蓋前請(qǐng)短暫離心，將蓋內(nèi)壁上的液體甩至管底，避免開蓋時(shí)液體灑落。

● 正式實(shí)驗(yàn)前，建議先做幾個(gè)孔摸索接種細(xì)胞的數(shù)量和加入CCK-8試劑后的培養(yǎng)時(shí)間。在之間摸細(xì)胞數(shù)量。培養(yǎng)時(shí)間一般在1-4小時(shí)。

● 部分藥物可能對(duì)檢測有影響，有影響時(shí)需換液后檢測，無影響時(shí)直接檢測。用培養(yǎng)基或PBS來配制待檢測藥物，加入CCK-8試劑，測藥物溶液在450nm處的吸光度。如果該吸光度與不含藥物僅加CCK-8試劑的培養(yǎng)基或PBS吸光度差異不大，則可以直接加入CCK-8，如果吸光度相對(duì)較大，則需要除去培養(yǎng)基，并用新鮮培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞兩次，然后加入新的100μL培養(yǎng)基和10μL CCK-8進(jìn)行檢測。

● 如果樣品為高渾濁度的細(xì)胞懸液，或者為了去除其他顏色物質(zhì)的影響，建議設(shè)定600nm(或600nm以上)作為參比波長，以OD450扣除參比波長的OD值即可。

● 接種時(shí)注意細(xì)胞懸液一定要混勻，以避免細(xì)胞沉淀下來，導(dǎo)致每孔中的細(xì)胞數(shù)量不等，可以每接種幾個(gè)孔就混勻一下。培養(yǎng)板周圍一圈孔培養(yǎng)基容易揮發(fā)，為了減少誤差，建議培養(yǎng)板的四邊每孔只加培養(yǎng)基，而不作為指標(biāo)檢測孔。

● 培養(yǎng)時(shí)間據(jù)細(xì)胞種類不同和每孔內(nèi)細(xì)胞數(shù)量的多少而異。一般情況下，白細(xì)胞較難染色，因此需要較長的培養(yǎng)時(shí)間或增加細(xì)胞數(shù)量(～10⁵個(gè)細(xì)胞/孔)。懸浮細(xì)胞與貼壁細(xì)胞相比較難染色。對(duì)千懸浮細(xì)胞，在培養(yǎng)1-4小時(shí)后，可先從培養(yǎng)箱中取出，目察染色程度或用酶標(biāo)儀測定決定。若染色困難，可將培養(yǎng)板放回培養(yǎng)箱，繼續(xù)培養(yǎng)數(shù)小時(shí)后再確定。染色的最佳時(shí)間可定為懸浮細(xì)胞的最佳培養(yǎng)時(shí)間。對(duì)于貼壁細(xì)胞，培養(yǎng)時(shí)間一般為1-4小時(shí)，但在培養(yǎng)30分鐘左右即可取出肉眼觀察染色程度(根據(jù)細(xì)胞種類而定，需要摸索一下條件)。當(dāng)時(shí)用標(biāo)準(zhǔn)96孔板時(shí)，貼壁細(xì)胞的最小接種量至少為1000個(gè)/孔(100μL培養(yǎng)基)。檢測白細(xì)胞時(shí)的靈敏度相對(duì)較低，因此推薦接種量不低于2500個(gè)/孔(100μL培養(yǎng)基)。如果要使用24孔板或6孔板實(shí)驗(yàn)，請(qǐng)先計(jì)算每孔相應(yīng)的接種量，并按照每孔相應(yīng)的接種量，并按照每孔培養(yǎng)基總體積的10%加入CCK-8溶液。

● 有條件的悄況下建議采用多通道移液器，可以減少平行孔間的差異。加CCK-8試劑時(shí)，建議斜貼著培養(yǎng)板壁加，不要插到培養(yǎng)基液面下加，容易產(chǎn)生氣泡，會(huì)干擾OD值度數(shù)。

● 若細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間較長，培養(yǎng)基顏色發(fā)生變化或pH發(fā)生變化，建議更換新鮮的培養(yǎng)基后再加CCK-8試劑。含有酚紅的培養(yǎng)基可用于本試劑盒做細(xì)胞活性的測定，酚紅不會(huì)影響檢測。

● 如果不是使用96孔板檢測，CCK-8溶液的用量相應(yīng)等比例增加即可。

● 本試劑盒可以用于細(xì)菌的檢測，不可用于酵母檢測。

● CCK-8試劑加樣量較小時(shí)，也可以用培養(yǎng)基稀釋CCK-8試劑后加樣以減小誤差。

● 本試劑無細(xì)胞毒性，可以在檢測后進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，也可以再進(jìn)行其他檢測。

● 某些細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中吸光度值太高，可以減少細(xì)胞數(shù)量，或者縮短加入CCK-8后的培養(yǎng)時(shí)間。

● 如果OD值偏低，可以適當(dāng)增加細(xì)胞數(shù)量或延長加入CCK-8后的培養(yǎng)時(shí)間。

● 接種細(xì)胞時(shí)要充分重懸，接種均勻。細(xì)胞是否接種均勻?qū)Y(jié)果影響較大。

● OD值在0.5-2.0之間均可，在1.0左右最佳，小于0.5或大于2.0請(qǐng)調(diào)整接種量和培養(yǎng)時(shí)間。

使用方法：

細(xì)胞活性、細(xì)胞增殖-毒性檢測

1、收集細(xì)胞，加細(xì)胞懸液100μL(約5000-10000個(gè)細(xì)胞)到96孔板(邊緣孔用無菌水或PBS填充)。每板設(shè)對(duì)照(加100μL培養(yǎng)基)。

2、置37℃,5% CO₂孵育過夜，倒置顯微鏡下觀察。

3、每孔加入10μL待檢測藥物溶液，37℃孵育。

4、每孔加入10μL CCK-8溶液，37℃孵育1-4小時(shí)。

5、測定450nm各孔的吸光值，如無450nm濾光片，可以使用450-490nm的濾光片。

6、同時(shí)設(shè)置空白孔(培養(yǎng)基和CCK-8溶液，無細(xì)胞)，對(duì)照孔(不加藥培養(yǎng)基和CCK-8溶液，有細(xì)胞)，每組設(shè)定3-5復(fù)孔。

【注】：

● 如果暫時(shí)不測定OD值，打算以后測定的話，可以向每孔中加入10μL 0.1M HCI溶液或者1%w/v SDS溶液，井遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下。在24小時(shí)內(nèi)吸光度不會(huì)發(fā)生變化。

● 如果待測物質(zhì)有氧化性或還原性的話，可在加CCK-8之前更換新鮮培養(yǎng)基，去掉藥物的影晌。當(dāng)然藥物影響比較小的情況可以不更換培養(yǎng)基，直接扣除培養(yǎng)基中加入藥物后的空白吸收即可。

細(xì)胞活力計(jì)算：

將各測試孔的OD值減去調(diào)零孔OD值或?qū)φ湛譕D值。各重復(fù)孔的OD值取平均數(shù)。

細(xì)胞活力％=(加藥細(xì)胞OD-空白OD/對(duì)照細(xì)胞OD-空白OD)×100

細(xì)胞數(shù)量測定

1、先用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)所制備的細(xì)胞懸液中的細(xì)胞數(shù)量，然后接種細(xì)胞。

2、按比例(例如：1/2比例)依次用培養(yǎng)基等比稀釋成一個(gè)細(xì)胞濃度梯度，一般要做3-5個(gè)細(xì)胞濃度梯度，每孔3-6個(gè)復(fù)孔。

3、接種后培養(yǎng)基24小時(shí)使細(xì)胞貼壁，然后加CCK-8試劑培養(yǎng)一定時(shí)間后測定OD值，制作出一條以細(xì)胞數(shù)量為橫坐標(biāo)(X軸)，OD值為縱坐標(biāo)(Y軸)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線可以測定出未知樣品的細(xì)胞數(shù)量(使用 此標(biāo)準(zhǔn)曲線的前提條件是實(shí)驗(yàn)的條件要一致，便于確定細(xì)胞的接種數(shù)量以及加入CCK-8后的培養(yǎng)時(shí)間)。

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