在激發波長488 nm,發射波長516nm附近,使用熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡、熒光分光光度計、熒光酶標儀、流式細胞儀等檢測O52F熒光,從而測定細胞內活性氮水平。本試劑盒可以用于各種真核培養細胞的檢測。...

檢測方法：

●熒光分光光度計 ● 熒光酶標儀 ● 流式細胞儀 ● 熒光顯微鏡 ● 激光共聚焦

樣本類型：

● 懸浮細胞 ● 貼壁細胞

試劑盒以外自備試劑和儀器：

● 激光共聚焦顯微鏡或熒光分光光度計或酶標儀或流式細胞儀,激發波長490±10 nm,發射波長510 ±10 nm,或者按照FITC熒光檢測條件檢測。

● PBS ● HBSS(不含酚紅) ● 移液器 ● 離心機 ● 熒光專用黑色96孔板

使用注意事項：

● 螺旋蓋微量試劑管裝的試劑在開蓋前請短暫離心,將蓋內壁上的液體收集至管底,避免開蓋時液體灑落。

● 熒光探針標記后,一定要洗凈殘余未進入細胞內的探針,否則導致背景較高。

● 探針標記完畢并洗凈殘余探針后,可以進行激發波長的掃描和發射波長的掃描,以確認探針的標記情況是否正常。

● 盡量縮短探針標記后到測定所用的時間,以減少各種可能的誤差。

● O52染色液為DMSO溶液,冬季氣溫較低時在室溫時為凝固狀態,極易粘附在管壁、吸頭壁。注意需要加熱溶解,吸頭也需要放在培養箱預熱,否者容易再次凝固在吸頭內壁產生損耗。

● 使用前,先將本品回溫至室溫,并對其進行簡短離心使DMSO 溶液集中于管底。

● 細胞處理需要小心操作,盡量避免人為的損傷細胞。

● 標記的條件因細胞種類而異,根據不同樣本的實際染色結果做相應調整,在每次實驗前,請先根據不同的實驗要求、細胞類型、細胞的膜通透性等進行優化,確定最佳條件。以下方法僅供參考。

● 酚紅對O52熒光探針的檢測有干擾,需避免。

● 染色后立即進行分析。

● 以下步驟僅做為參考,稀釋比例和孵育時間可根據實際情況來調整。比如,對于某些細胞,如果發現未被刺激的陰性對照細胞熒光也比較強,可降低探針濃度。如果發現用感興趣的藥物刺激后熒光較弱,可升高O52探針濃度,以提高檢測的靈敏度。另外,探針裝載的時間也可以根據情況在15-60分鐘內適當進行調整,孵育溫度在4℃-37℃內調整。

● 必須使用熒光檢測專用的黑色96孔板。

使用方法：

1、探針染色工作液配制：

根據樣本數量,用HBSS將O52熒光染料100倍稀釋,配制成染色工作液。

【注】:

● 建議收到產品后,根據單次使用量,對母液進行小量分裝,每次使用一管,試劑-20℃避光凍存,一年穩定。

● 實驗前,使用HBSS或PBS稀釋儲存液到需要的工作濃度。工作濃度為根據不同細胞的預實驗結果確定的最佳工作濃度,一般染色終濃度100-1000倍稀釋。

● 可以用無血清的培養基稀釋探針,不可以用含血清的培養基稀釋。

● 為了降低過度加載染料導致的潛在背景和線粒體毒性,在不影響實驗結果的前提下應盡可能低濃度染色。另外,濃度過高也可能造成非特異性染色,對其他細胞結構進行染色。

● 工作液現配現用。

2、細胞探針標記

2.1 原位標記：僅適用于貼壁培養細胞

1)培養皿/培養板準備細胞樣本。

2)待細胞生長到合適豐度,去除細胞培養基,用PBS洗細胞一次。

3)加入適量體積37℃預熱的含O52探針工作液。

【注】:

● 加入的體積以能充分蓋住細胞為宜，通常對于6孔板的一個孔加入稀釋好的O52探針不少于1mL，96孔板加入100-200μL。

● 也可以將細胞置于培養皿中的蓋玻片上,加入合適培養基,使其爬片生長。

4)在37℃細胞培養箱內于生長狀態下孵育20～40分鐘(具體孵育時間需根據細胞類型而定,需預實驗優化)。

5)移除染色液,用PBS(pH7.4)洗滌細胞3次。以充分去除未進入細胞內的O52探針。

【注】:

● 若染色不夠充分,建議增加染料濃度或延長染色時間。

● 也可以用HBSS/無血清細胞培養基洗滌細胞。

6) 加入200μL HBSS緩沖液。

【注】:

● 也可以用PBS/細胞培養基。

7)熒光顯微鏡(含合適濾片)或熒光酶標儀下觀察。最大激發/發射波長為488/516nm。

2.2 收集后標記：懸浮細胞或貼壁細胞消化處理

1)離心,吸除上清培養基。

2)用PBS洗細胞一次。

3)細胞收集后重懸浮于稀釋好的37℃預熱的O52探針工作液中，細胞濃度為1×10⁶-2×10⁷/mL。

4)于生長狀態下37℃細胞培養箱內避光孵育20-30分鐘（具體時間需根據細胞類型而定，需預實驗優化）。每隔3-5分鐘顛倒混勻一下，使探針和細胞充分接觸。

5)離心，吸除染色液，加入PBS（pH7.4）重懸細胞，洗滌3次。以充分去除未進入細胞內的O52探針。

6)用HBSS/PBS/無血清細胞培養基重懸細胞。

7)用熒光光度計、熒光酶標儀、流式細胞儀檢測。

最大激發/發射波長為488nm/516nm。

【注】:

● 對于懸浮細胞,也可將細胞貼附于經細胞粘合劑處理過的蓋玻片上,然后使用類似于貼壁細胞的方法進行染色。

● 如果需要蓋玻片上固定化的細胞,那么可在鋪片前可以先用多聚賴氨酸(poly-D-lysine)包被載玻片或蓋玻片。

● 若染色不夠充分,建議增加染料濃度或延長染色時間。

3、檢測：

1)對于原位標記探針的樣品可以用熒光酶標儀檢測，或者用激光共聚焦顯微鏡、熒光顯微鏡，直接拍照分析（需要有相關的熒光強度分析軟件）。

2)或收集細胞后標記探針然后用熒光分光光度計、熒光酶標儀或流式細胞儀檢測。

3)對于收集細胞后標記探針的樣品可以用熒光分光光度計、熒光酶標儀或流式細胞儀檢測，用激光共聚焦顯微鏡直接拍照分析也可以（需要有相關的熒光強度分析軟件）。

4)使用488nm激發波長，520nm發射波長，實時或逐時間點檢測刺激前后熒光的強弱。

探針O52的熒光光譜和FITC非常相似，可以用FITC的參數設置檢測。

5) 熒光強度強，活性氮含量高。

【注】:

● 如果用顯微鏡拍照分析的話，需要細胞分布均勻。

● 要結合明場的照片具體分析。如果細胞分布均勻算固定面積熒光強度。成像時中心和四周有差異時，一般將四周剪切掉也可以。如果細胞分布不勻，需要找到細胞分布勻稱的視野，一個視野一個視野找。如果要用圖片做結果，就要平行做多個圖片，作分析，統計，每張都要求熒光分布盡量一致。

● 為了去除雜光的影響，可以適當調節統計熒光的強度范圍，將信號過弱的背景雜光去除掉。

● 對照組和實驗組整張圖片需要做同樣的處理，保證所有參數均要一致。

● 對于不同情況熒光強度的統計方法，根據實驗需要或參考文獻。可以算等面積的平均強度；也可以算閾值高于一定值的平均強度；也可以算熒光的累積而不算平均。

要根據課題需要選擇合適的測量統計方法。

常見問題分析：

● 活性氮結果如何分析？

RNS是多種物質的統稱，不像某一單一活性氮指標，無法檢測其絕對的含量，只能通過設置參照樣本，以參照樣本的倍數來反映目標樣本相對含量變化，這個“相對”是針對參照的。分析結果是定性的，也是沒有單位的，因為它本質上是一個比值（目標/參照）。反映的是模型樣本通過具體的干預措施（如養分缺失、缺氧、藥物治療或遺傳基因操控等）如何影響其RNS的變化，測定其RNS是增加或者降低了。

● 熒光照片如何分析？

需要有相關的熒光強度分析軟件。RNS表達水平直接通過熒光信號的強弱和分布范圍來體現。

有的顯微鏡掃描下來的圖像本身就可以測面積和強度，可以同時測不同顏色的熒光強度。有的顯微鏡不支持此功能，可以將熒光染色彩色圖像轉換為黑白的灰度圖，然后再以灰度值作為測量指標進行分析。

要結合明場的照片具體分析。如果細胞分布均勻可以算固定面積熒光強度。成像時中心和四周有差異時，一般將四周剪切掉也可以。如果細胞分布不勻，需要找到細胞分布勻稱的視野，一個視野一個視野找。

如果要用圖片做結果，就要平行做多個圖片，作分析，統計，每張都要求熒光分布盡量一致。

為了去除雜光的影響，可以適當調節統計熒光的強度范圍，將信號過弱的背景雜光去除掉。對照組和實驗組整張圖片需要做同樣的處理，保證所有參數均要一致。

對于不同情況熒光強度的統計方法，根據實驗需要或參考文獻。可以算等面積的平均強度；也可以算閾值高于一定值的平均強度；也可以算熒光的累積而不算平均。

要根據課題需要選擇合適的測量統計方法。

● 熒光照片效果不好？

熒光拍照存在很多變量，每一個變量都會嚴重影響拍照效果。

熒光拍攝條件：拍攝環境、顯微鏡品牌和激發熒光決定了鏡下觀察的效果。同樣的操作方法和切片，在不同品牌顯微鏡下顯示出完全不同的熒光強度。

熒光衰減：熒光物質的衰減通常都是非常明顯的。同樣的一組切片，1小時內拍攝和8小時后拍攝，熒光效果完全不同。

最好用激光共聚焦顯微鏡，激光共聚焦顯微鏡的分辨率比普通熒光顯微鏡要高的多，通常同一張片子激光共聚焦的效果明顯更優。

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