CFSE/7-AAD雙染細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒是利用細(xì)胞熒光染料CFSE(CFDA-SE)和7-AAD對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，利用CFSE標(biāo)記靶細(xì)胞，7-AAD標(biāo)記死的靶細(xì)胞來(lái)區(qū)分不同的細(xì)胞，活的靶細(xì)胞成綠色，死的靶細(xì)胞成紅色和綠色，從而檢測(cè)細(xì)胞毒性作用。根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)，可以用來(lái)檢測(cè)化合物的細(xì)胞毒性作用。也可以用來(lái)檢測(cè)殺傷性T 細(xì)胞或NK 細(xì)胞...

檢測(cè)方法：

● 熒光顯微鏡 ● 流式細(xì)胞儀 ● 激光共聚焦

樣本類(lèi)型：

● 懸浮細(xì)胞 ● 貼壁細(xì)胞

試劑盒以外自備試劑和儀器:

● 流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡或激光共聚焦 ● 離心機(jī) ● CO₂培養(yǎng)箱 ● PBS或者HBSS（不含酚紅） ● 熒光專(zhuān)用黑色96孔板

使用方法：

細(xì)胞CFSE染色：

1.根據(jù)需要檢測(cè)的細(xì)胞樣品數(shù)，用HBSS將CFSE母液200～4000倍稀釋?zhuān)渲瞥蒀FSE染色工作液。不同的細(xì)胞需要根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定最佳染色濃度。如果熒光強(qiáng)度弱，可以適當(dāng)提高CFSE的終濃度。如果背景太高，可以適當(dāng)降低CFSE的終濃度，請(qǐng)摸索條件找到最佳濃度。

【注】：

● 也可以用HBSS等緩沖液或相應(yīng)的無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋染料母液至所需濃度。

● 開(kāi)始實(shí)驗(yàn)前，使用HBSS緩沖液或培養(yǎng)基稀釋CFSE到需要的工作濃度。工作濃度為根據(jù)不同細(xì)胞的預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定的最佳工作濃度，一般染色終濃度200～4000倍稀釋。

● 一般起始濃度按500～1000倍稀釋即可。

● 為了降低過(guò)度加載染料導(dǎo)致的潛在背景和細(xì)胞毒性，在不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的前提下應(yīng)盡可能低濃度染色。

● 工作液現(xiàn)配現(xiàn)用。

2.將培養(yǎng)好的待測(cè)靶細(xì)胞消化后收集，用PBS洗滌2次。

【注】：

● 400×g離心5分鐘。

3.將待測(cè)細(xì)胞用染色工作液重懸，至細(xì)胞濃度大約10⁷/ml。

4.在37℃培養(yǎng)箱中避光孵育15～30分鐘。

5.加10倍體積的含血清培養(yǎng)基，400×g離心5分鐘。

6.離心后去上清，收集細(xì)胞，用HBSS或無(wú)血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞1～2次，最后加入培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。

7.在37℃培養(yǎng)箱中孵育20～30分鐘。

細(xì)胞模型制備：

1.收集待檢測(cè)的靶細(xì)胞。

2.進(jìn)行相應(yīng)的毒性藥物處理或者效應(yīng)細(xì)胞處理。

【注】：

● 效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞比例根據(jù)需要自行設(shè)定。常見(jiàn)比例如6.25：1；12.5：1；25：1等。

● 活的靶細(xì)胞成綠色；死的靶細(xì)胞成紅色和綠色；死的效應(yīng)細(xì)胞成紅色，活的效應(yīng)細(xì)胞成無(wú)色。

細(xì)胞檢測(cè)：

1.收集制備好的毒性處理過(guò)的細(xì)胞模型。

2.用200μL HBSS重懸細(xì)胞，加入1μL 7-AAD染色液，混勻。

【注】：

● 微量的染色液注意有效的加入細(xì)胞懸液并充分混勻。

● 可以根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定的染色液濃度，直接用7-AAD和HBSS緩沖液配制成染色工作液，并用染色工作液重懸細(xì)胞。

3.在2～8℃避光孵育10～60分鐘。

4.在400×g離心5分鐘收集細(xì)胞。

5.用500μL HBSS或PBS重懸細(xì)胞。

6.取500μL細(xì)胞懸液，用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡檢測(cè)。

7.根據(jù)流式結(jié)果計(jì)算死亡細(xì)胞百分率。被殺傷死亡的靶細(xì)胞被7-AAD染上會(huì)出現(xiàn)在CFSE+7-AAD+區(qū)域，未殺傷的在CFSE+7-AAD-區(qū)域，得出被殺傷的靶細(xì)胞的比例。用這個(gè)比例再計(jì)算毒性。

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