超級雜交液(芯片)的品牌是百奧萊博，是優質的探針標記及檢測產品，本制品用于科研試驗，我公司專注于探針標記及檢測產品的研發、生產和供應，為您提供的超級雜交液(芯片)質量可靠，批間差小，且價格公道，熱切盼望您選購我們的產品。...

特別提示：包括超級雜交液(芯片)在內，本公司的所有產品僅可用于科研實驗，嚴禁用于臨床醫療及其他非科研用途！

產品名稱：超級雜交液(芯片)
英文名稱：Super hybrid solution(chip)
產品貨號：BTN130905
產品規格：10mL

基因芯片是將大量靶基因(DNA片段)有序地、高密度地點在玻璃片或硅片或塑料片上等載體上所形成的矩陣。基因芯片雜交一般情況下是將待測的兩種樣品(主要是RNA樣品)分別用Cy3和Cy5兩種熒光染料標記，制備成探針與芯片雜交，雜交信號用激光掃描儀檢測，計算機分析檢測結果，可獲得類似與傳統的點雜交的雜交數據，以達到快速、、高通量及平行性的分析表達譜的目的。本產品為即用型芯片專用的雜交液，可用于各種標記的探針(主要是Cy3和Cy5標記的RNA探針)跟基因芯片的雜交實驗。

儲存條件：低溫運輸，-20℃保存，有效期一年。

使用方法：
一、預雜交(下面的操作以載玻片為例)
 預雜交的主要作用是在加入標記探針之前從載玻片上洗去未結合的靶基因(靶DNA)，同時封閉載玻片表面可能與標記探針進行非特異性結合的反應性基團(如自由氨基)，從而降低非特異的背景。所有的預雜交、雜交、雜交后洗滌都在Coplin染缸或者顯微鏡載玻片盤等雜交盒中進行。
1.在室溫下，將載玻片浸入裝有本產品的雜交盒中(本產品的用量根據雜交盒的大小決定，以能夠浸埋載玻片為準)。將雜交盒在42℃水浴中放置30～45分鐘，無需震動。
2.在室溫下用去離子水清洗載玻片數次。
3.(可選)用異丙醇(HPLC級)漂洗載玻片。
4.在加入雜交溶液之前，空氣晾干或者通過離心(室溫下以2000g離心5分鐘，有陣列的一面朝外)干燥載玻片，將干燥后的載玻片立即用于雜交。如果載玻片干燥時間超過1小時，雜交效率可能會迅速下降。
二、雜交
1. 將等同于至少1μg polyA RNA或100μg總RNA的Cy3和Cy5標記的探針RNA混合在一起，zuì終體積約為6μL。如果沒有這么多的，則需要進行RNA擴增。
2. 將6μl標記DNA和30μL本產品在塑料離心管中混合，得到雜交液。
3.(可選)將雜交液在微量離心機中10,000 g離心5分鐘，然后將上清液轉移到新的塑料離心管中。本步驟以去除靶序列純化過程中帶入的微量玻璃纖維和其他高分子質量的顆粒。
4. 將上清液在100℃下加熱2分鐘，然后在30℃水浴中冷卻30秒。加熱混合液可以降低背景。不要將溶液放置在冰上，因為可能會有沉淀析出。
5. 將適量的雜交溶液加到DNA微陣列上，再小心的蓋上蓋玻片，蓋玻片和DNA微陣列之間不能有氣泡。
6. 將載玻片置于一個空的移液器吸頭盒的上層，下層裝5mL自備的3×SSC，蓋上蓋子即得潮濕的環境。由于雜交是在很小的體積下進行的，在密閉的潮濕保持適當的雜交適度非常重要，過分干燥則蓋玻片會粘附在DNA微陣列上，背景會很高；過于潮濕則冷凝的液體會進入蓋玻片區域，降低雜交信號。
7.在42℃下將載玻片溫育14~16小時。
三、雜交后的清洗
 注意在下面的所有操作過程中，一定不要讓載玻片干燥。
1.雜交完畢，拆卸雜交盒。如果雜交盒是浸入水浴中的，在松開螺絲之前，仔細擦干水痕，尤其是兩個半片盒子之間的水痕。
2.從雜交盒中取出載玻片，浸沒于大量的0.5×SSC(含0.01 % SDS)溶液中，直到蓋玻片分離。
3. 蓋玻片除去后，將載玻片放到玻片夾持器上，然后浸入裝有約250mL 0.5×SSC(含0.01 % SDS)溶液的避光容器中。將容器放在軌道振蕩器上，并將載玻片振蕩2分鐘。
4. 將載玻片和夾持器一起浸入到另一個裝有約250mL 0.5×SSC溶液的容器中，再次將載玻片振蕩3分鐘。
5. 將載玻片和夾持器一起浸入到另一個裝有約250mL 0.1×SSC溶液的容器中，再次將載玻片振蕩3分鐘。
6. 重復上一步2次，每次清洗1分鐘。
7.快速(<10秒)將載玻片和夾持器一起浸入到另一個裝有約250mL 0.01×SSC溶液的容器中，立即將載玻片放到鋪有3M Whatman濾紙的離心機微量滴定板夾持器中。低速離心約5分鐘迅速干燥玻片。
8. 將載玻片放置在避光的盒子內直到準備掃描。(盡量在當日內進行掃描，因為隨著時間的延長信號會降低)

疑難解答：
問題一：高背景(熒光或黑洞)
解決方案：對標記探針進行足夠的純化；清洗過程中操作要迅速，避免載玻片干燥；雜交溶液需要與載玻片基底相匹配。
問題二：沒有雜交信號或雜交信號非常弱
解決方案：雜交過程中應該連續振蕩，不應該有氣泡，避免玻片變干；檢查RNA的純化和標記；更換雜交試劑。

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貨號	名稱	規格
BTN90605C	TdT加尾法DNAdì高辛標記試劑盒	5次
BTN130907	脫脂奶粉	50g
BTN100809	SSPE溶液，20×	250mL
KFS165	Ca2+ GPCR分析-鈣離子指示探針 Fluo-2, AM	200μL
KFS176	鉀離子熒光探針	1mg
KFS377	活性氧ROS檢測熒光探針-DHE,紅300/610	5mg
SY0559	7-氨基放線菌素D	1mg

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名稱：PCR法DNA探針標記試劑盒
貨號：BTN90604A
規格：5次
PCR標記的原理是用帶標記的dNTP進行PCR，zuì后得到的PCR產物將帶有標記，可以直接用于雜交試驗。其原理示意圖如下：


產品特點：
1.一站式，本試劑盒提供經過優化的試劑，不需要用戶自己摸索。
2. 足夠10次50μl體系的常規PCR(用于制備標記反應的模板和設置對照反應)和5次50μl體系的標記反應。
3.一次標記可以得到μg級的雙鏈DNA探針或約700ng的單鏈DNA探針，足夠多次雜交實驗用。
4. 既可用于制備雙鏈探針，也可以用于單鏈探針。
5. 90604A需自備含標記核苷酸的dNTP，90604B和90604C分別含生物素和dì高辛標記的底物。自備的標記包括fluorescein-dUTP、hydroxycoumarin-dUTP、resorufin-dUTP和aminoallyl-dUTP等。
6. 本產品得到的探針參入率一般為4-5%(每100個核苷酸中有4-5個將帶有非同位素標記)，有效降低了空間阻礙，檢測效果zuì佳。
7.可以用于Southern和Northern Blot、原位雜交、菌落和斑點印跡雜交等分析。

試劑盒組成：

成分	規格
2×標記專用PCR Mix	500μl
dNTP，2mM each	50μl
含Biotin-11-dUTP的dNTP	25μL(僅B有)
含DIG-11-dUTP的dNTP	25μL(僅C有)
超純水	1ml
說明書	1份

注：標記專用PCR Mix不含dNTP。

儲存條件：低溫運輸，-20℃保存，有效期一年。

使用方法：

一：準備工作
1. 按常規的方法設計PCR引物，使探針長度在400-800bp之間。過短則標記參入少，探針雜交信號強度減弱；過長則非特異雜交增加，背景變強。
2. 根據PCR引物優化PCR條件。
3. 由于標記的dNTP比較珍貴，所以本試劑盒不推薦以基因組DNA或其他復雜DNA為模板直接進行PCR標記，而是建議采取下述的兩步法標記來提高成功率，即先制備非標記PCR產物，再以之為模板制備標記的PCR產物。
二：非標記PCR產物的制備
4. 設置50μL PCR的反應體系：

成份	用量
2×標記專用PCR Mix	25μl
dNTP，2mM each	5μl
自備的探針引物一(10pmol/μL)	1μL(10μM)
自備的探針引物二(10pmol/μL)	1μL(10μM)
自備的模板DNA	1μg基因組DNA或1ng質粒DNA
超純水	補到50μL

5. 按已經優化的PCR參數進行PCR。
6.電泳檢測和膠回收所需的PCR產物，并定量。用10 pmol引物一般能得到1μg左右的PCR產物(具體取決于PCR產物的長度)。注意：zuì好采取膠回收而不是PCR回收以避免殘留引物干擾后續的標記PCR。
三：標記PCR反應(zuì好做一個不加標記的對照用于定量)
說明：在設置下面反應時，如果加一種引物，就得到單鏈標記的PCR產物；如果加兩種引物，則得到雙鏈標記的PCR產物。由于雙鏈PCR探針在雜交前雖然要變性成單鏈后使用，但雜交時變性的雙鏈彼此還會復性，這種復性會與探針-靶DNA雜交反應相競爭，降低雜交效率，因此強烈推薦使用單鏈標記的DNA探針。

成份	樣品	對照
2×標記專用PCR Mix	25μl	25μl
含Biotin-11-dUTP的dNTP或 含DIG-11-dUTP的dNTP或 自備的含其他標記dUTP的dNTP	5μl	不加
dNTP，2mM	不加	5μl
雙鏈標記：探針引物一和引物二 單鏈標記：探針引物一或引物二	每種50 pmol 一種50 pmol	每種50 pmol 一種50 pmol
上步膠純化所得PCR產物 (單鏈標記可用100ng)	10 ng	10 ng
超純水	補到50μL	補到50μL

 注意：本試劑盒提供的dNTP混合物中，標記底物與非標記底物的比例已經進過優化，如果自備標記dUTP，其與dTTP的zuì佳比例需要優化，標記不同，比例不同。對DIG-11-dUTP，zuì佳比例1：3；對BrdUTP，zuì佳比例為1：1。
7. 按第5步的PCR參數進行標記PCR，但需要進行下列修改：一是循環數增加到35-55個循環。由于模板為純化后的PCR產物，探針對擴增長度完整性要求不高(長度不均的探針由于能形成網絡結構，效果反而更好)，所以可以增加循環數；二是延伸時間增加15秒，因為標記dUTP參入到DNA的速度比常規的dTTP慢；三是降低復性溫度5-7℃，因為標記核苷酸參入到DNA后，新模板的Tm值將降低。
8. 標記探針的定量：取標記反應和對照反應的產物1-5μl，在瓊脂糖凝膠上跟濃度已知的DNA marker一起電泳，并判斷探針的濃度。由于標記反應的PCR產物中額外帶有非同位素的配體(生物素，dì高辛等)、因此其泳動速度將慢于非標記PCR產物(但同位素標記不能用此法)。
 注意：如果擴增的是單鏈DNA探針，其結合EB的能力遠低于雙鏈DNA(EB是嵌合到雙鏈堿基對之間的，而單鏈DNA沒有堿基對，只有一些局部區域折疊形成的有限雙鏈區，因此能結合的EB很少)，因此EB染色的強弱不能準確反應DNA的濃度，可以采用銀染定量(跟marker比較)。一般100ng模板按上述條件經過單鏈PCR擴增可得到700ng左右探針。
9. 剩余的PCR標記產物可以不經過純化，直接加入(對單鏈PCR探針)雜或加熱變性并急冷后加入(對雙鏈PCR探針)到雜交液中使用。如果暫時不用請放-20℃長期保存。如果需要純化，請使用乙酸銨/乙醇沉淀法。

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