豬高致病性藍耳病毒RT-PCR檢由北京百奧萊博供貨并提供相關技術服務支持，本品用于生化實驗研究等領域，本品質量穩(wěn)定，價位合理，需要豬高致病性藍耳病毒RT-PCR檢等病毒PCR檢測試劑盒產品的客戶，請到我公司官網聯(lián)系我們。...

特別提示：包括豬高致病性藍耳病毒RT-PCR檢測試劑盒在內，本公司的所有產品僅可用于科研實驗，嚴禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途！

產品名稱：豬高致病性藍耳病毒RT-PCR檢測試劑盒
英文名稱：PRRSV RT-PCR Kit
產品貨號：BTN11-290
產品規(guī)格：50次

豬藍耳病是一種高致病性的傳染病，不同年齡、品種和性別的豬均能感染，但以妊娠期母豬和 1 月齡的仔豬zuì易感染，主要的癥狀為母豬流產，產死胎、弱胎、木乃伊胎及呼吸困難、敗血癥、高死亡率等為主要特征。高致病性豬藍耳病是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV） 變異株引起的一種急性高致病性傳染病。仔豬發(fā)病率達 、死亡率達 50% 以上，母豬流產率達30%以上。由于高致病性 PRRSV 毒力強、傳播速度快、發(fā)病率高、病死率高，到目前為止，藍耳病已蔓延到，每年都有巨大的經濟損失，對養(yǎng)豬業(yè)構成了嚴重的威脅。因此建立一種快速、高靈敏度的診斷高致病性豬藍耳病的方法具有很重要的社會和經濟價值。本產品就是針對這一需求開發(fā)的RT-PCR產品。

產品特點：
1. 即開即用，用戶只需要提供病毒RNA模板。
2. 傳統(tǒng)PRRSV的鑒定方法，如免疫熒光實驗方法、檢測抗體的 ELISA血清病毒中和實驗、免疫組化、間接免疫熒光試驗、免疫過氧化酶單層實驗等血清學方法，具有一定的局限性并不能夠區(qū)分高致病性藍耳病和低致病性藍耳病。因為高致病性藍耳病在1590～1591bp之間與低致病性藍耳病相比較有連續(xù)的87 bp的堿基缺失，所以高致病性的擴張產物為 460 bp明顯低于低致病性藍耳病的547 bp，通過此方法即能夠快速判斷毒株的類型又能夠區(qū)分其是否為高致病性。
3. 兩管式RT-PCR，一次RT反應產物可以作為多次PCR的模板。本試劑盒提供10次的RT反應試劑和50次的PCR試劑。
4. 引物經過優(yōu)化，特異性高，引物是根據高致病性藍耳病基因的保守序列設計，產物長度為460 bp。
5. PCR mix中含上樣染料，PCR后可以直接上樣電泳。

產品組成：

組分	編號	規(guī)格(50T)
MMLV逆轉錄酶 (含RI)	BTN80206A	20 μL
RT Buffer（含dNTP）	BTN80206B	60 μL
RNase-free水	BTN80403	10mL
PCR MagicMix 3.0	BTN90805	1.5mL
PRRSV陽性對照	BTN10101011	100 μL
PRRSV專一性引物一（正向引物）	yw1010	100 μL
PRRSV專一性引物二（反向引物）	yw1011	120 μL
超純水	BTN100935	1mL

保存條件：-20℃保存，有效期12個月。

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一、簡介：
本試劑盒針對諾如病毒通用型高度保守區(qū)域設計特異性引物和探針，在反應體系中含諾如病毒通用型基因組模板的情況下，PCR反應得以進行并釋放熒光信號。利用儀器對PCR過程中相應通道的信號強度進行實時監(jiān)測和輸出，實現檢測結果的定性分析。

二、用途：
諾如病毒(Norwalk Viruses，NV)是人類杯狀病毒科(Human Calicivirus，HuCV)中諾如病毒(Norovirus,NV)屬的原型代表株。有5個基因群(Gene group G)GI、GII、GIII、GIV、GV。諾如病毒感染性腹瀉在全范圍內均有流行，全年均可發(fā)生感染，感染對象主要是成人和學齡兒童，寒冷季節(jié)呈現高發(fā)。

三、試劑盒組成：(50T/Kit)
組份 數量 規(guī)格
RT-PCR反應液(NV-qRT-PCR MIX) 1管 672μL/管
酶混合物(Enzymes MIX) 1管 48μL/管
無核酸酶水(Nuclease-Free Water) 1管 500μL/管
陰性對照(NTC) 1管 50μL/管
陽性對照(NV-PTC) 1管 50μL/管

四、儲存條件及有效期：
本試劑盒于-20℃以下保存，有效期為6個月。

五、熒光PCR儀器適用范圍：
ABI系列，伯樂系列，Roche系列等熒光定量PCR檢測儀等。

六、樣品的采集與RNA提取
6.1 樣品的采集
1. 采集時間：糞便樣本應在發(fā)病日采集，至多不能超過發(fā)病急性期(48～72h)，此時為稀、軟便，病毒排出量zuì多。
2. 采集方法
(1)一次流行，至少采集10例患者糞便，每份樣本量約1～5mL，成形便和肛拭子診斷意義很??；
(2)病人嘔吐物是糞便樣本的zuì佳補充，有助于病原的診斷。采集、儲存和運送條件同于糞便；
(3)從流行病學角度出發(fā)，在水、食物或其它外環(huán)境樣本中檢出NV意義重要；
(4)需注意檢測技術要鎖定在高度懷疑的傳播媒介上，盡早采樣并置4℃存放，若是飲用水，需用大容量(5～100L)濃集病毒后檢測；
3.應避免樣本間交叉污染。
4.樣本收集后可立即檢測；若不能立即檢測，可置于-20℃以下過夜保存；如需長期保存，樣本應凍存于-70℃以下，避免反復凍融。
6.2 RNA提取
可采購北京百奧萊博科技有限公司的RNA提取試劑盒(過柱法-熒光配套)或其他合適的商業(yè)化產品，并按照相應試劑盒說明進行操作。
 注：陽性對照和陰性對照為已經抽提好的核酸(無需提取)，直接取5μL加入到反應體系中即可。由于陽性對照濃度較高，建議zuì后在樣品制備區(qū)域加入陽性對照。

七、檢測步驟：
7.1 試劑的準備
從試劑盒中取出熒光qRT-PCR反應液(NV-qRT-PCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振蕩混勻后，10000rpm離心10s。
設所需要的PCR反應管管數為N(N=樣本數+1管陰性對照+1管陽性對照)，每個測試反應體系配制如下表：
試劑 每個反應加入的量 N個反應加入的量
熒光PCR反應液 14μL N×14μL
酶混合物 1 μL N×1μL
總量 15μL N×15μL
計算好各試劑的使用量，加入一適當體積潔凈離心管中，充分混勻，10000rpm離心10s，向設定的N個PCR反應管中分別加入15μL，向每管中加入處理后樣品/陰性對照(NTC)/陽性對照(NV-PTC)5μL，10000rpm瞬時離心10秒。
7.2 qRT-PCR反應條件
將各反應管放入實時熒光PCR儀器的反應槽內。
推薦循環(huán)條件:
反轉錄(Reverse Transcription) 1循環(huán) 45℃ for 10 min
預變性 1循環(huán) 95℃ for 10 min
PCR擴增 40循環(huán) 95℃ for 15 sec
60℃ for 45 sec
在55℃延伸時收集熒光信號。報告基團：設置為FAM，淬滅基團：NONE，請勿選擇ROX參比熒光。

八、結果分析：
8.1 結果分析條件設定
直接讀取檢測結果?；€和閾值設定原則根據儀器噪聲情況進行調整，以閾值線剛好超過正常陰性樣品擴增曲線的zuì高點為準。
8.2 試驗成立判定
（1） 陰性對照(NTC)：不應產生任何的擴增曲線。
（2） 陽性對照(NV-PTC)：均產生擴增曲線。
（3） 以上條件應同時滿足，否則，此次試驗視為無效。
8.3 結果判定
（1） 在試驗成立的條件下，Ct值≤35的樣本為陽性，表明NV核酸陽性。
（2） Ct值顯示為無的樣本為陰性樣本，表明NV核酸陰性。
（3） 如果35＜Ct值≤40，判為可疑樣品。對于可疑樣品，先看擴增曲線。如果擴增曲線為對數擴增曲線，則為可疑陽性，否則判為陰性。
（4） 對于可疑陽性樣品，重新抽提核酸，再次進行NV qRT-PCR檢測。如果重復擴增曲線為對數擴增曲線，判為樣本陽性，表明NV核酸陽性；否則判為樣本陰性。

九、注意事項：
（1） 初次使用前請仔細閱讀說明書。并嚴格按照說明書步驟操作。
（2） 所有使用的離心管zuì好高壓滅菌，而且必須不含RNA酶。
（3） PCR操作應嚴格按照要求分區(qū)(試劑配制區(qū)、標本處理區(qū)、PCR擴增區(qū)等)，防止實驗室污染。
（4） 樣本提取、試劑配置、加樣需在不同區(qū)的超凈工作臺進行，以免污染。
（5） 試劑盒里所有物品應視為污染物對待，并按照衛(wèi)生部《微生物生物醫(yī)學實驗室生物安全通則》進行處理。


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