柱式水樣DNA提取試劑盒的品牌是百奧萊博，是優質的DNA提取純化產品，本制品僅用于生物化學研究方面，我公司專注于DNA提取純化產品的研發、生產和供應，為您提供的柱式水樣DNA提取試劑盒質量可靠，批間差小，且價格公道，熱切盼望您選購我們的產品。...

特別提示：包括柱式水樣DNA提取試劑盒在內，本公司的所有產品僅可用于科研實驗，嚴禁用于臨床醫療及其他非科研用途！

產品名稱：柱式水樣DNA提取試劑盒
英文名稱：Liquid sample DNA column extraction kit
產品貨號：BTN101112
產品規格：50次



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名稱：柱式動物線粒體DNA提取試劑盒(測序級)
貨號：BTN120501
規格：15次
本試劑盒就是基于先純化動物細胞線粒體、再從中柱式法純化其DNA的兩步法試劑盒。

試劑盒特點：
1. 即開即用，用戶不需要自己配制各種溶液，優化各種條件。
2. 兩步法，先純化線粒體，再柱式法純化其中的DNA，有粗提(mtDNA純化前不用DNase處理線粒體)和精提(mtDNA純化前用DNase處理線粒體)兩套操作方案，適合于各種要求不同的后續實驗。
3. 本產品一次可以處理約107×108個培養細胞，10mg培養細胞(相當于5瓶150 mm培養細胞)可以純化到到0.2-0.5mg線粒體。
4. 本產品適用于各種動物懸浮培養細胞和貼壁培養細胞，不建議用于動物實體組織。
5. 提供線粒體染液，可以在操作中隨時監測純化過程中線粒體的完整性。

試劑盒組成：

成分	規格	備注
溶液A	225ml	配制勻漿液
蔗糖	25.4g	配制勻漿液
詹納斯染色液	1ml	染色線粒體
溶液B	0.5ml	配制核酸酶反應液
DNase A干粉	1mg	酶切細胞核DNA
Benzonase(1U/μL)	100μl	酶切細胞核DNA
溶液C	10ml	純化mtDNA
溶液D	5ml	純化mtDNA
溶液E	20ml	純化mtDNA
離心吸附柱	15套	純化mtDNA
通用洗柱液	15ml	純化mtDNA
DNA洗脫液	10ml	純化mtDNA
人TPMT VNTR	上游引物	GCT CCG CCC TGC CCA TTT
	下游引物	GCC TCC GCC ACC AAT GAC
人線粒體HV2區	上游引物	GGT CTA TCA CCC TAT TAA CCA C
	下游引物	CTG TTA AAA GTG CAT ACC GCC A
說明書	1份

儲存條件：常溫運輸和保存，保存期限一年。

使用方法：
注意：線粒體膜對溫度高度敏感，所以整個操作必須在冰上或冷室進行，所要用到的溶液和離心管都必須預先冷卻，否則線粒體容易破裂。

一：線粒體粗提
1. 稱25.4g蔗糖到225mL溶液A中，蓋上蓋子后充分搖晃3～5分鐘溶解即得250mL溶液A工作液，放冰上預冷待用。未用完的溶液A工作液需要-20℃保存，否則會長菌。
2. 如果是單層細胞，先用20mL PBS緩沖液洗滌107×108個培養的單層細胞，共洗滌2次。然后用塑料刮匙刮下細胞，重懸在20mL PBS緩沖液中。如果是懸浮細胞，則1000g 4℃離心10分鐘收集107×108個細胞，再用20mL PBS緩沖液洗滌2次，zuì后將細胞重懸在20mL PBS緩沖液中。
3. 用平甩轉子(swinging-bucket rotor)離心機1000 g 4℃離心10分鐘，吸棄上清，保留細胞沉淀。
4. 加入5倍體積(以細胞沉淀的體積為基數)的溶液A工作液，輕柔重懸細胞。
5. 如果是成纖維細胞，由于其難于裂解，可將細胞重懸液在-80℃放置20-30分鐘后再化凍，然后進入下步操作。如果不是，則直接進入下步操作。
6. 將細胞重懸液體轉移到預冷的Dounce玻璃勻漿器中(工作體積為10-15mL，間隙為0.12 mm，zuì好是玻璃材質，否則線粒體產率會降低)勻漿適當次數。細胞株不同，其zuì適勻漿次數不同，一般需要40次-60次左右。勻漿是線粒體純化zuì關鍵的步驟，故勻漿前zuì好先通過預實驗確定zuì適勻漿次數，方法是每勻漿5-10次后，取2-3μl勻漿液到載玻片上，然后在相差顯微鏡下觀察，完整細胞數量降低到20-50%以下為佳。
7. 用平甩轉子離心機4℃ 1000 g離心10分鐘。沉淀含殘留完整細胞、細胞碎片和細胞核，上清液含線粒體。
8.轉移上清液到離心管中，冰上放置待用。如有必要，可在顯微鏡下檢測上清液中線粒體的完整性。具體做法是先滴一滴上清液到載玻片上，再滴入50μl詹納斯染液染色20分鐘，油鏡下觀察，藍綠色顆粒狀物即為線粒體。
9. 用固定角度轉子(fixed-angle rotor)離心機4℃ 10000 g離心10分鐘，棄上清，所得棕黑色沉淀即為粗提線粒體沉淀。
10. 用5mL溶液A工作液洗滌2次得線粒體粗提液(即重懸后，4℃ 10000 g離心10分鐘，棄上清)。
11. 如果后續實驗是提取mtDNA用于PCR或Southern雜交，則直接進入第3部分mtDNA提取，也可以放-80℃長期保存待用。
12. 如果后續實驗是提取mtDNA用于高通量測序，則必須徹底降解掉其中的細胞核DNA污染。勻漿過程中一個破裂的細胞核釋放出的DNA相當于上百萬個線粒體的DNA量之合，所以無論如何小心，粗提線粒體中必有大量的細胞核DNA污染，如果不將其清除，高通量測得的序列將大部分來于核DNA而非mtDNA。

二：線粒體粗提液中細胞核DNA的去除及鑒定
13. 將線粒體重懸于0.3mL溶液A工作液中，取10μl作為未處理對照。
14. 加入6μl Benzonase(1U/μL)溶液和30μl DNase A溶液(配法：將0.5mL溶液B加到裝有1mg DNase A干粉的離心管中得到2mg/mL溶液，未用完的部分需要分裝后放-20℃保存)。
15. 37℃保溫一段時間酶切細胞核DNA。注意：zuì好先預實驗，每隔一段時間取10μl樣品，滅活其中的DNase后作為模板用PCR擴增1-4個自選的VNTR位點和1-2個mtDNA基因(如vis或COII基因)，檢測不到VNTR基因而能檢測到mtDNA基因的處理時間為zuì佳。可從本公司另購細胞核基因和線粒體基因專一性引物。
16. 加入10μl自備的0.5M EDTA溶液(pH8.0)以終止酶反應。顯微鏡下檢查線粒體完整性(見上節第8步)。
17. 用固定角度轉子離心機4℃10000 g離心10分鐘，棄上清。
18. 用1mL的溶液A工作液洗滌沉淀(即重懸后，4℃ 10000 g離心10分鐘，棄上清。此為一次洗滌。)2次得到線粒體沉淀。

三：線粒體DNA提取
19.在不超過100μl的線粒體沉淀中加入600μl預熱的溶液C到沉淀中，充分吹打均勻。
20. 再加入150μl(可稱150-160mg)預熱的溶液D到離心管中，顛倒數次混勻。此時溶液中可能有白色絲狀懸浮物產生。
21. 65℃放置3～5分鐘。
22. 加入200μl自備lǜ仿，震蕩混勻10-30秒，此時溶液將呈乳白色。
23. 12000～15000g室溫離心2分鐘。此時上清液將變得透明，中間層有白膜。小心轉移上清液到一個新的1.5mL塑料離心管中，避免觸及中間的白膜。
24. 加入1.5倍體積的溶液E，顛倒混勻后全部轉移到離心吸附柱中，室溫放置至少2分鐘。
25. 12000rpm室溫離心1分鐘，棄收集管中的穿透液。
26. 通用洗柱液洗滌2次(將0.5mL加入離心柱中，12000rpm室溫離心1分鐘，棄穿透液，此為洗滌一次，再重復一次)。
27. 空甩半分鐘去除殘留液體,將離心吸附柱轉移到新的1.5mL離心管中。
28. 加30-50μl DNA 洗脫液，室溫放置3～5分鐘。
29. 12000rpm室溫離心1分鐘即得純化的mtDNA溶液。

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