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特別提示：包括一步法Real-Time RT-qPCR試劑盒(高含量ROX校正染料)在內，本公司的所有產品僅可用于科研實驗，嚴禁用于臨床醫療及其他非科研用途！

產品名稱：一步法Real-Time RT-qPCR試劑盒(高含量ROX校正染料)
英文名稱：SuperSYBR One Step RT-qPCR Kit(High ROX)
產品貨號：WE0139
產品規格：100次

  本試劑盒是一步法Real-Time RT-qPCR專用試劑盒。所含的SYBR Green I熒光染料可以與所有的雙鏈DNA相結合，使該產品可以用于多種不同靶序列的檢測而不需合成特異性標記探針。使用本產品進行Real Time RT-qPCR反應，逆轉錄和定量PCR在同一反應體系中進行，反應過程中無需添加試劑，無需打開管蓋，避免了污染的同時提高了實驗效率。全新逆轉錄酶RNase H活性缺失，減少了逆轉錄反應中RNA的降解。該酶逆轉錄效率高，可對少量 RNA模板進行良好的逆轉錄反應。與RNA親合性高，能通讀GC含量高，二級結構復雜的RNA模板。全新熱啟動酶，在常溫下酶的活性被封閉，從而有效避免在常溫條件下由引物和模板非特異性結合或引物二聚體而產生的非特異性擴增，大提高了熒光定量PCR反應的性。所包含的緩沖系統使以上兩種酶同時發揮zuì大功效，提率。本產品靈敏度高，特異性高，線性范圍廣，對目的基因定量更準確。

ROX染料用于校正定量PCR儀孔與孔之間產生的熒光信號誤差，一般用于ABI、Stratagene等公司的Real Time PCR 擴增儀。不同儀器的激發光學系統有所不同，因此ROX染料的濃度必須與相應的熒光定量PCR儀相匹配。

不需要ROX校正的儀器:(WE0137)
Roche LightCycler 480，Roche LightCyler 96，Bio-rad iCyler iQ，iQ5，CFX96等。
需要Low ROX校正的儀器：(WE0138)
ABI Prism7500/7500 Fast，QuantStudio® 3 System，QuantStudio® 5 System，QuantStudio® 6 Flex System，QuantStudio® 7 Flex System，ViiA 7 system，Stratagene Mx3000/Mx3005P，Corbett Rotor Gene 3000等。
需要High ROX校正的儀器：(WE0139)
ABI Prism7000/7300/7700/7900，Eppendorf，ABI Step One/Step One Plus等。

試劑盒組成：

組份	WE0137-100次	WE0138-100次	WE0139-100次
2×SuperSYBR One Step Buffer	1.4ml	1.4ml	1.4ml
SuperSYBR One Step EnzymeMix	50μl	50μl	50μl
50×Low ROX	-	50μl	-
50×High ROX	-	-	50μl
RNase-Free Water	1.5ml	1.5ml	1.5ml

注意事項：
1、本試劑盒中的各試劑使用前請上下顛倒輕輕混勻，盡量避免起泡，并經短暫離心后使用。
2、本產品以RNA為模板進行一步法RT-PCR實驗，在操作過程中應避免RNase污染，建議在專門的區域進行RNA操作，使用專門的儀器和耗材，操作人員帶口罩和一次性手套并經常更換手套，實驗相關耗材應用0.1%DEPC(焦碳酸二乙酯)水溶液在37℃處理12小時,并高壓滅菌30分鐘后使用。
3、SuperSYBR One Step RT-qPCR Buffer中含有SYBR Green I 熒光染料，保存本產品或配制PCR反應液時應避免強光照射。
4、本試劑盒中的各試劑應避免反復凍融，反復凍融可能使產品性能下降。本產品長期保存可置于-20℃，避光。如果在短期內需要頻繁使用，可在2～8℃保存。
5、本試劑盒必須使用特異性引物，引物的選擇可根據具體實驗來選擇，引物設計的好壞直接影響到RT-PCR反應的結果，設計引物時需考慮GC含量，引物長度，引物位置，PCR產物的二級結構等因素，建議采用專業的引物設計軟件進行設計。
6、本品不能用于探針法熒光定量PCR。

操作步驟：
1、將RNA模板、引物、2×SuperSYBR One Step Buffer、SuperSYBR One Step EnzymeMix和RNase-Free Water溶解并置于冰上備用。
2、PCR反應體系

試劑	25μl反應體系	終濃度
2×SuperSYBR One Step Buffer	12.5μl	1×
Forward Primer，10μM	0.5μl	0.2μM
Reverse Primer，10μM	0.5μl	0.2μM
SuperSYBR One Step EnzymeMix	0.5μl
RNA Template	Xμl	10 pg～100ng
50×Low ROX or High ROX(optional)	0.5μl	1×
RNase-Free Water	up to 25μl

注意：
1)通常引物濃度以0.2μM可以得到較好結果，可以終濃度0.1-0.5μM作為設定范圍的參考。擴增效率不高的情況下，可提高引物的濃度；發生非特異性反應時，可降低引物濃度，由此優化反應體系。
2)不同儀器的激發光學系統有所不同，根據使用熒光定量的儀器選擇加入50×Low ROX or 50×High ROX。

3、渦旋震蕩混勻，短暫離心，將溶液收集到管底。
4、RT-qPCR反應條件(熒光定量PCR為兩步法)，本程序是以ABI 7500熒光定量PCR儀為例。

步驟	溫度	時間	循環數
反轉錄	45℃	10 min
PCR預變性	95℃	5 min
變性	95℃	10 s	30-40個循環
退火/延伸	60℃	45 s
融解曲線分析	95℃	15 s
	60℃	1 min
	95℃	15 s
	60℃	15 s

注意：
1)建議采用兩步法PCR反應程序，若提高反應特異性，可提高退火溫度，以60-64℃作為設定范圍的參考；若因使用Tm值較低的引物等原因，得不到良好的實驗結果時，可嘗試進行三步法PCR擴增。
2)融解曲線分析請以所使用的熒光定量PCR儀推薦的程序進行設定，本程序是以ABI7500熒光定量PCR儀為參照設定。

RT-qPCR反應條件(熒光定量PCR為三步法)：

步驟	溫度	時間	循環數
反轉錄	45℃	10min
PCR預變性	95℃	5min
變性	95℃	15s	30-40 個循環
退火	56℃-64℃	30s
延伸	72℃	30s
融解曲線分析	95℃	15s
	60℃	1min
	95℃	15s
	60℃	15s

注意：
1)三步法PCR擴增時，退火溫度請以 56℃-64℃的范圍作為設定參考。
2)融解曲線分析請以所使用的熒光定量PCR儀推薦的程序進行設定，本程序是以ABI 7500熒光定量PCR儀為參照設定。

儲存條件：-20℃，避免反復凍融

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名稱：石蠟油，PCR級
貨號：BTN130841
規格：10mL
本產品是PCR級石蠟油試劑，專門用于PCR擴增、WGA擴增等實驗時添加到反應體系中，封閉反應成分，防止溶液的揮發。

儲存條件：常溫運輸及保存，有效期一年。

名稱：miRNA熒光定量RT-PCR檢測試劑盒
貨號：BTN131042
規格：25次
本試劑盒采用SYBR Green I 嵌合熒光染料法的原理來進行miRNA熒光定量PCR檢測。本產品是專門為miRNA定量檢測而研發的新一代預混形式的熒光定量PCR檢測試劑。2×miRNA qPCR Mix包含有Taq DNA聚合酶、dNTPs、MgCl2、反應緩沖液、PCR增強劑等所有PCR所需要的成分。miRNA qPCR Mix中所含的熒光染料SYBR Green I可以與所有的雙鏈DNA結合，使該產品可用于不同靶序列的檢測而不需合成特異性標記探針。其中的Taq DNA polymerase是經化學修飾的熱啟動酶，配合獨特的緩沖體系，使反應特異性更好，靈敏度更高，并能在更廣的范圍內對miRNA進行準確定量。

產品特點：
1. 簡便、快捷完成miRNA的檢測。
2. 檢測通量高，只需zuì少的RNA樣本，即可同時進行多種目標miRNA的檢測。
3. 檢測特異性好，獨特的miRNA引物設計技術及其優化的反應體系避免了非特異性擴增、特別是Pre-miRNA的污染。
4. 檢測分辨率高：該系統能分辨單堿基差異的miRNA。
5. 檢測靈敏度高：可在低至pg級的總RNA中檢測到特異表達的miRNA。

試劑盒組成：

成分	規格
2×miRNA qPCR Mix	0.75ml
Reverse Primer(10μm)	30μl
RNase-Free Water	1ml
miRNA cDNA鏈合成試劑盒	25T
說明書	1份

儲存條件：低溫運輸，-20℃保存，有效期一年。

使用方法：

一、miRNA cDNA鏈合成
請參見miRNA cDNA 鏈合成試劑盒產品使用說明書。

二、miRNA熒光定量檢測
1.室溫融化2×miRNA qPCR Mix和Reverse primer(10μm)。
2. 使用時請將2×miRNA qPCR Mix上下顛倒輕輕均勻混合，避免起泡，并經短暫離心后使用。如果試劑沒有混勻，其反應性能會有所下降。
3. 按照下表組分配制熒光定量PCR反應體系：

試劑組份	體積
2×miRNA qPCR Mix	25μl
Forward Primer(自備)	1μl
Reverse Primer	1μl
miRNA 鏈cDNA	xμl
RNase-Free Water	至50μl

4. 建議反應程序設置如下：

循環	溫度	時間
1×	95℃	10min
40～45×	95℃	15s
	60℃	1min
溶解曲線分析	根據PCR儀要求設定

注意事項：
1. miRNA 鏈cDNA的加入量不要超過Real time PCR 體積10%。
2. 對于特殊的檢測體系，高含量的cDNA 模板易導致非特異性擴增，根據所檢測miRNA的豐度適當的稀釋cDNA(稀釋10倍或者100倍)。
3. 2×miRNA qPCR Mix中含有SYBR Green I和ROX染料，保存本產品或配制PCR反應液時應避免強光照射。

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