內質網染色試劑盒是利用E系列探針進行內質網特異性染色的試劑盒。本試劑盒中的E04內質網染色探針為紅色熒光標記的內質網探針，具有586nm/616nm的激發/發射波長。...

內質網染色試劑盒(紅色熒光)

 

產品編號：HR9083

產品組成：

儲存條件：

染料-20℃避光保存，避免反復凍融。有效期6個月。

【注】：

● 染料短期2周內可以2-8℃保存。染料長期不用可以-20℃保存。避免反復凍融。

● 染色液A為DMSO溶液，冬季氣溫較低時為凝固狀態，極易粘附在管壁、吸頭壁。注意需要加熱融解，變成液體狀態后離心至管底部再開蓋。

● 可以用手捂住使其融解或37℃短時間水浴。吸頭也需要放在培養箱預熱，否者容易再次凝固在吸頭內壁產生損耗。

內質網染色試劑盒(紅色熒光)產品簡介：

內質網染色試劑盒是利用E系列探針進行內質網特異性染色的試劑盒。本試劑盒中的E04內質網染色探針為紅色熒光標記的內質網探針，具有586nm/616nm的激發/發射波長。

E系列探針是一種細胞滲透型的對活細胞中的內質網體進行選擇性染色的一類新型熒光染料，該系列探針可以選擇性標記內質網。只需簡單孵育細胞，即可穿過細胞膜并直接聚集在活性內質網上。可有效標記活細胞。一旦內質網被染色后，還能根據后續實驗的需求進行固定(醛類固定劑如甲醛)和透化(醛類去污劑如Triton X-100)，探針依然維持在細胞內。

檢測方法：

● 熒光顯微鏡

● 激光共聚焦

樣本類型：

● 懸浮細胞

● 貼壁細胞

試劑盒以外自備試劑和儀器：

● 熒光顯微鏡/激光共聚焦 ● 離心機

● PBS ● 或者HBSS(無酚紅)

注意事項：

● E04染色液為DMSO溶液，冬季氣溫較低時在室溫時為凝固狀態，極易粘附在管壁、吸頭壁。注意需要加熱溶解，吸頭也需要放在培養箱預熱，否者容易再次凝固在吸頭內壁產生損耗。

● 用前，先將本品取出回溫至室溫，并對其進行簡短離心使DMSO溶液集中于管底。

● 細胞處理需要小心操作,盡量避免人為的損傷細胞。

● 標記的條件因細胞種類而異，根據不同樣本的實際染色結果做相應調整，在每次實驗前，請先根據不同的實驗要求、細胞類型、細胞的膜通透性等進行優化，確定最佳條件。以下方法僅供參考。

● 最好使用HBSS緩沖液(含Ca²⁺、Mg²⁺ Hank’s平衡鹽溶液)稀釋該探針進行染色，可得到最佳實驗結果。

● E04染料具有環境敏感性，工作液條件發生改變E04 會隨之出現極性增強、最大熒光波長偏移到更高波長處、量子產量下降等現象。

● 染色后立即進行分析。

● 操作過程中需要盡量避光。

使用方法：

1、染色工作液配制：

根據樣本數量，用37℃培養箱預熱HBSS或PBS或其他緩沖液將E04熒光染料500倍稀釋。配制成染色工作液。(對于后續需要做固定或透化的樣本，200倍稀釋)

【注】：

● 建議收到產品后，根據使用量，對母液進行小量分裝，每次使用一管，試劑-20℃避光凍存，一年穩定。

● 開始實驗前，使用HBSS或培養基緩沖液稀釋儲存液到需要的工作濃度。工作濃度為根據不同細胞的預實驗結果確定的最佳工作濃度，一般染色終濃度為試劑盒中染料母液的500倍稀釋。

● 為了降低過度加載染料導致的潛在背景和內質網毒性，在不影響實驗結果的前提下應盡可能低濃度染色。另外，濃度過高也可能造成非特異性染色，對其他細胞結構進行染色。

● 工作液現配現用。

● 為了降低探針加載過度可能引起的假陽性，建議在不影響染色效果的情況下盡量使用低濃度。

● 使用含Ca²⁺、Mg²⁺ Hank’s平衡鹽溶液(HBSS/Ca/Mg)稀釋該探針進行染色，可得到最佳實驗結果。

● 以下實驗方案經牛肺動脈內皮細胞優化，且已被其他常規細胞系驗證。但不同細胞類型其最佳使用條件不同，還需用戶根據該方案進行進一步優化染色濃度和時間。

2、細胞染色

內質網染色試劑盒(紅色熒光)2.1 對于貼壁細胞

1)培養皿/培養板準備細胞樣本。

2)待細胞生長到合適豐度，吸除培養液，用HBSS緩沖液洗滌細胞，加入適量37℃預熱的含探針工作液。于生長狀態下孵育15分鐘～40分鐘(具體孵育時間需根據細胞類型而定，需預實驗優化)。

【注】：

● 也可以將細胞置于培養皿中的蓋玻片上，加入合適培養基，使其爬片生長。

3)利用新鮮培養基替換上述染色液。

【注】：

● 若染色不夠充分，建議增加染料濃度或延長染色時間。

4)熒光顯微鏡(含合適濾片)或激光共聚焦顯微鏡下觀察。或者進行后續的固定步驟。

激發/發射波長為586/616nm。

2.2 對于懸浮細胞

1)用HBSS洗滌細胞。

2)利用37℃預熱的探針工作液重懸細胞，于生長狀態下孵育15分鐘～40分鐘(具體時間需根據細胞類型而定，需預實驗優化)。

3)離心，吸除染色液，加入新鮮培養液重懸細胞。

4)置于熒光鏡下觀察。或激光共聚焦顯微鏡檢測。激發/發射波長為586/616nm。或者進行后續的固定步驟。

【注】：

● 對于懸浮細胞，也可將細胞貼附于經細胞粘合劑處理過的蓋玻片上，然后使用類似于貼壁細胞的方法進行染色。

● 如果需要蓋玻片上固定化的細胞，那么可在鋪片前可以先用多聚賴氨酸(poly-D-lysine)包被載玻片或蓋玻片。

● 若染色不夠充分，建議增加染料濃度或延長染色時間。

● 已染色細胞用醛固定后，僅部分E04探針留在細胞內，熒光信號會有衰減。

常見問題分析：

● 可以對細胞進行固定嗎？

已染色細胞固定后，僅部分熒光探針留在細胞內，熒光信號會有部分衰減。

 

● 固定細胞的方法？

染色后清洗，小心吸走清洗液。換用新鮮配制且預熱的含4%甲醛的緩沖液或培養液進行細胞固定。用4%甲醛于37℃固定細胞2min。 細胞固定后，可用合適緩沖液進行清洗，每次5min，共2次。清洗后可對細胞進行后續封片、鏡檢或進一步染色。

● 可以對細胞進行透化處理嗎？

不建議對細胞進行透化處理，因為經Triton X-100或其它透化劑透化后，細胞內將無熒光信號保留。

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