端粒酶重復片段擴增試劑盒由專業(yè)試劑供應商北京百奧萊博提供，用于科研試驗，我公司專注于基因結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)品的研發(fā)、生產(chǎn)和供應，為您提供的端粒酶重復片段擴增試劑盒質(zhì)量可靠，批間差小，且價格公道，熱切盼望您選購我們的產(chǎn)品。...

特別提示：包括端粒酶重復片段擴增試劑盒(TRAP試劑盒)在內(nèi)，本公司的所有產(chǎn)品僅可用于科研實驗，嚴禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途！

產(chǎn)品名稱：端粒酶重復片段擴增試劑盒(TRAP試劑盒)
英文名稱：Telomeric Repeat Amplification Protocol Kit
產(chǎn)品貨號：BTN111009
產(chǎn)品規(guī)格：50次

本品是我司在經(jīng)典TRAP技術(shù)基礎(chǔ)上改良而得，專門用于快速測定人類細胞端粒酶的相對活性(需要跟對照樣品比較)。端粒酶存在于85-90%的腫瘤組織中，因此通過檢測端粒酶活性就能早期診斷大多數(shù)腫瘤。目前zuì常用的檢測端粒酶活性的方法就是TRAP，它利用端粒酶能在外加的TS模板DNA的末端添加不同數(shù)量的TTAGGG序列這一特點，通過PCR檢測延伸產(chǎn)物而檢測端粒酶活性。原理如下：


產(chǎn)品特點：
1．一站式，提供從細胞裂解到PCR的所有試劑，但不含PAGE和銀染試劑。
2．一管式操作，端粒酶延伸和PCR在同一體系中完成，方便快捷。
3．提供改良的、長為150bp的內(nèi)參和含8個端粒序列的合成端粒，可有效排除PCR假陰性。內(nèi)參長度遠大于TRAP產(chǎn)物，不會干擾結(jié)果分析。
4．改良的TS模板和PCR引物，大降低了引物二聚體的形成。
5．既可用于培養(yǎng)細胞，也可用于實體組織。
6．靈敏度高，zuì低可以檢測到10個腫瘤細胞中的端粒酶活性。

試劑盒組成：

成分	規(guī)格
TRAP細胞裂解液	10mL
PCR Mix 3.0	1.5mL
合成端粒(PC)	50μL
TS-引物混合物(含內(nèi)參)	300μL
超純水	1mL
說明書	1份

儲存條件：低溫運輸，-20℃保存，有效期一年。

使用方法：

一、端粒酶的提取
注意：端粒酶是蛋白質(zhì)和RNA組成的復合體，RNA容易被降解，因此，提取端粒酶應該跟提取RNA一樣，盡量在低溫條件下快速操作，并且必須使用RNase-free的耗材，桌面zuì好用固相RNase清除劑清潔(BTN3090)清潔。
1．對冷凍的實體組織：將50-100mg冷凍組織在液氮中用預冷的研磨器研磨成粉末，再轉(zhuǎn)移到預冷的玻璃勻漿器中，加入200μl預冷的TRAP細胞裂解液，溫和手動勻漿數(shù)次后冰浴30分鐘，每間隔數(shù)分鐘渦旋振蕩一次，共5-6次，然后直接進入第3步操作。為保證裂解效果，可在顯微鏡下觀察。如果組織樣品不足50-100mg，可以按比例降低TRAP細胞裂解液的用量。
2．對新鮮的培養(yǎng)細胞和組織：用自備的預冷PBS洗滌105-106個經(jīng)過胰酶處理的細胞或50-100mg新鮮組織，3000g 4℃離心5分鐘，棄上清；加入200μL預冷的TRAP細胞裂解液懸浮細胞或組織。對細胞：渦旋振蕩10秒后置冰浴30分鐘，每間隔數(shù)分鐘渦旋振蕩一次，共5-6次。對組織：在冰上用玻璃勻漿器輕柔勻漿后冰浴30分鐘，每間隔數(shù)分鐘渦旋振蕩一次，共5-6次。如果細胞不足1×106或50-100mg，可按比例降低TRAP裂解液的用量。
3．12000-14000g 4℃離心20分鐘。
4．收集160μL上清，先取部分用于測定蛋白質(zhì)濃度，可通過測定215nm和225nm的光吸收得到，計算公式是蛋白質(zhì)濃度(μg/μL)=0.144×(A215-A225)×稀釋倍數(shù)，也可使用BCA法測定蛋白濃度。本試劑盒制備的細胞裂解物的蛋白濃度一般在10-750 ng/μL。知道各樣品的蛋白濃度后，可用TRAP細胞裂解液將各樣品的蛋白濃度調(diào)成一樣便于比較，然后按10μL/管分裝得到至少15管裂解物，放-80℃冷凍保存(可存放一年)。每個樣品可取一管進行熱滅活(95℃處理10分鐘)后再放-80℃冷凍保存，此管將作為該樣品的陰性對照。

二、TRAP反應
5．確定每個TRAP反應的細胞裂解物用量：為便于分析比較，每個TRAP反應所用的蛋白量(或細胞數(shù))必須一樣。由于細胞裂解物中一般都有高濃度的不明Taq DNA聚合酶抑制物(TRAP失敗zuì常見的原因)，因此zuì佳結(jié)果往往是用稀釋10-1000倍后的細胞裂解物得到。建議用一個樣品稀釋不同濃度做TRAP預實驗。
6．在PCR管中按下表設置TRAP反應(50μL反應體系，以A和B兩個樣品為例)：

成份	A樣品管	A陰性 對照管	B樣品管	B陰性 對照管	實驗 陰性對照	實驗 陽性對照
A樣品	2μl	-	-	-	-	-
A陰性對照	-	2μl	-	-	-	-
B樣品	-	-	2μl	-	-	-
B陰性對照	-	-	-	2μl	-	-
TRAP細胞裂解液	-	-	-	-	2μl	-
合成端粒	-	-	-	-	-	2μl
TS引物混合物	6μl	6μl	6μl	6μl	6μl	6μl
PCR Mix	25μl	25μl	25μl	25μl	25μl	25μl
超純水	17μl	17μl	17μl	17μl	17μl	17μl

 注：為避免污染，zuì好等其他樣品加完并蓋上蓋后再加合成端粒。
7．吹打混勻后進行PCR擴增，擴增條件(僅供參考，用戶可優(yōu)化)如下：

步驟	溫度	時間
端粒酶延伸	30℃	30min
端粒酶滅活	95℃	5min
PCR(循環(huán)35次)	94℃	30s
	55℃	60s
	72℃	30s

三、PAGE-銀染檢測及結(jié)果解讀(本試劑盒不含PAGE-銀染檢測試劑盒)
8．取5μL PCR反應液進行10%非變性PAGE電泳-銀染顯色實驗(需另購本公司PAGE電泳套裝和銀染試劑盒)。如果背景高(主要是由反應體系中的蛋白成分引起)，可以行PCR產(chǎn)物純化再進行PAGE電泳和銀染。
9．跟預期結(jié)果(見下表)比較。如果結(jié)果跟下表不一致，則需要按具體情況分析原因。

現(xiàn)象	樣品管結(jié)果	樣品陰性 對照結(jié)果	實驗陰性 對照結(jié)果	實驗陽性 對照結(jié)果
典型TRAP條帶 (條帶數(shù)不限)	有則有端粒酶活性 無則無端粒酶活性	不出現(xiàn)	不出現(xiàn)	不出現(xiàn)
陽性對照的TRAP 條帶(僅8條帶)	不出現(xiàn)	不出現(xiàn)	不出現(xiàn)	出現(xiàn)
150bp內(nèi)參	可出現(xiàn)可不出現(xiàn)	出現(xiàn)	出現(xiàn)	出現(xiàn)

 注：本試劑盒所用引物產(chǎn)生的典型TRAP條帶zuì小條帶為59bp。

疑難解答：
1．如果樣品管有內(nèi)參帶，但沒有TRAP條帶，可能是端粒酶活性低或者失活。制備細胞裂解物時可在TRAP細胞裂解液中加入1/100體積的RNase抑制劑以抑制RNase活性，并在端粒延伸反應后增加DNA純化一步，純化后的DNA再用于PCR。此兩步法TRAP需要用戶自備DNA純化試劑和dNTP。
2．如果樣品對照管(端粒酶已經(jīng)滅活)出現(xiàn)TRAP條帶，可能是TRAP產(chǎn)物污染，需要使用潔凈的PCR管和PCR試管架。樣品制備、PCR設置和電泳需在不同房間進行。也可能是端粒酶沒有徹底滅活，建議用RNase酶解法或酶解+熱滅活法。
3．實驗陰性對照管的實驗結(jié)果中出現(xiàn)TRAP條帶，可能是引物二聚體，可采取兩步法TRAP，并且將DNA模板加入到70℃預熱的PCR Mix3.0中再進行PCR。
4．實驗結(jié)果不好時，可以直接采取2步法，先做端粒酶延伸和滅活，然后再純化DNA，用純化的DNA做PCR。此法需要用戶自備dNTP。

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