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產品名稱：肺炎支原體單重熒光PCR檢測試劑盒
產品貨號：SYA035
產品規格：48次/盒



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名稱：志賀氏菌單重熒光PCR檢測試劑盒
貨號：SYA003
規格：48次/盒
一、簡介：
志賀氏菌屬(Shigella)是一類革蘭氏陰性桿菌，是人類細菌性痢疾zuì為常見的病原菌，通稱痢疾桿菌。人類及其它動物對志賀氏菌易感，10-200個細菌即可致病。本方法為熒光PCR檢測方法，反應在同一管內進行，操作簡單，并有效防止了污染，能對樣品中或預培養液中的志賀氏菌進行快速檢測，具有特異性高、敏感性強和操作簡便的特點。志賀氏菌的探針報告基團為FAM，淬滅基團為None。

二、用途：
該試劑盒適合于增菌培養物、疑似病料及食品中志賀氏菌的檢測。

三、試劑盒組成：(50T/Kit)
組份 數量 規格
志賀氏菌熒光qPCR反應液(Shig-qPCR MIX) 1管 750μL/管
DNA抽提液(DNA Extraction) 2管 1.5mL/管
陰性對照(NTC) 1管 50μL/管
陽性對照(Shig-PTC) 1管 50μL/管

四、儲存條件及有效期：
本試劑盒于-18℃以下保存，有效期為6個月。

五、熒光PCR儀器適用范圍：
ABI系列，Roche系列等熒光定量PCR檢測儀等。

六、樣品的采集與DNA提取
6.1 樣品的采集
6.1.1 食品樣品：樣品采集與預培養參照《中華人民共和國標準 食品安家標準食品微生物學檢驗志賀氏菌檢驗(GB 4789.5-2012)》要求進行。
6.1.2 糞便樣品：取糞便置于滅菌的收集管中送檢。
6.1.3 病灶部位樣品：取發病部位新鮮滲出物、粘液膿血送檢。
 注：上述樣品建議經過增菌后，收集培養物用于檢測。
6.2 DNA提取(用戶可根據需要選擇商業化DNA提取試劑盒)
6.2.1 培養物：取培養物50μL(培養至一定濁度)或者挑取單克隆菌落與50μL DNA抽提液充分混勻，100℃恒溫10min，13000rpm離心3min，取上清5μL進行PCR反應。
6.2.2 糞便樣品：挑取米粒大小糞便于滅菌離心管中，加入0.5mL生理鹽水，振蕩混勻，13000rpm離心3分鐘，棄上清，沉淀中加入50μL DNA抽提液充分混勻，100℃恒溫10min，13000rpm離心3min取上清5μL進行PCR反應。
6.2.3 其他液體標本：取標本2-3mL，13000rpm離心3min，棄上清，沉淀中加入50μl DNA抽提液充分混勻，100℃恒溫10min，13000rpm離心3min取上清5μL進行PCR反應。
 注：陽性對照和陰性對照為已經抽提好的核酸(無需提取)，直接取5μL加入到反應體系中即可。由于陽性對照濃度較高，建議zuì后在樣品制備區域加入陽性對照。

七、檢測步驟：
7.1 試劑的準備
從試劑盒中取出熒光qPCR反應液(Shig-qPCR MIX)，冰上融化并振蕩混勻后，10000rpm離心10s。
設所需要的PCR反應管管數為N(N=樣本數+1管陰性對照+1管陽性對照)，每個測試反應體系配制如下：
試劑 每個反應加入的量 N個反應加入的量
熒光PCR反應液 15μL N×15μL
向設定的N個PCR反應管中分別加入15μL熒光PCR反應液，向每管中加入處理后樣品/陰性對照(NTC)/陽性對照(Shig-PTC)5μL，10000rpm瞬時離心10秒。
7.2 qPCR反應條件
將各反應管放入實時熒光PCR儀器的反應槽內。
推薦循環條件:
1循環 50℃ for 2 min
預變性 1循環 95℃ for 10 min
PCR擴增 40循環 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸時收集熒光信號。報告基團：設置為FAM。

八、結果分析：
8.1 結果分析條件設定
直接讀取檢測結果。基線和閾值設定原則根據儀器噪聲情況進行調整，以閾值線剛好超過正常陰性樣品擴增曲線的zuì高點為準。
8.2 試驗成立判定
（1） 陰性對照(NTC)：不應產生任何的擴增曲線。
（2） 陽性對照(Shig-PTC)：均產生擴增曲線。
（3） 以上條件應同時滿足，否則，此次試驗視為無效。
8.3 結果判定
（1） 在試驗成立的條件下，Ct值≤35的樣本為陽性，表明Shig核酸陽性。
（2） Ct值顯示為無的樣本為陰性樣本，表明Shig核酸陰性。
（3） 如果35＜Ct值≤40，判為可疑樣品。對于可疑樣品，先看擴增曲線。如果擴增曲線為對數擴增曲線，則為可疑陽性，否則判為陰性。
（4） 對于可疑陽性樣品，重新抽提核酸，再次進行Shig qPCR檢測。如果重復擴增曲線為對數擴增曲線，判為樣本陽性，表明Shig核酸陽性；否則判為樣本陰性。

九、注意事項：
（1） 初次使用前請仔細閱讀說明書。并嚴格按照說明書步驟操作。
（2） 所有使用的離心管zuì好高壓滅菌，而且必須不含DNA酶。
（3） PCR操作應嚴格按照要求分區(試劑配制區、標本處理區、PCR擴增區等)，防止實驗室污染。
（4） 樣本提取、試劑配置、加樣需在不同區的超凈工作臺進行，以免污染。
（5） 試劑盒里所有物品應視為污染物對待，并按照衛生部《微生物生物醫學實驗室生物安全通則》進行處理。


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