SuperSYBR Mixtur的品牌是百奧萊博，是優(yōu)質的核酸擴增(PCR)產品，本制品僅用于生物化學研究方面，本產品質量好，且具價格，深為用戶稱道，了解更多SuperSYBR Mixtur等核酸擴增(PCR)產品請聯(lián)系我司咨詢訂購。...

特別提示：包括SuperSYBR Mixture(不含ROX校正染料)在內，本公司的所有產品僅可用于科研實驗，嚴禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途！

產品名稱：SuperSYBR Mixture(不含ROX校正染料)
英文名稱：SuperSYBR Mixture
產品貨號：WE0136
產品規(guī)格：1ml|5ml

  本品是專用于染料法(SYBR Green I)實時熒光定量PCR的預混體系，濃度為2×，包含 BaldStar Taq DNA Polymerase、PCR Buffer、dNTPs、SYBR Green I 熒光染料和Mg2+，操作簡單。主要用于基因組DNA靶序列和RNA反轉錄后cDNA靶序列的檢測。
  本品所含的熒光染料SYBR Green I 可以與所有的雙鏈DNA結合，使該產品可用于不同靶序列的檢測而不需合成特異性標記探針。其中BaldStar Taq DNA Polymerase是一種經化學修飾的、全新熱啟動酶，在常溫下沒有聚合酶活性，有效避免在常溫條件下由引物和模板非特異性結合或引物二聚體而產生的非特異性擴增，酶的激活須在95℃下孵育10分鐘。獨特的PCR緩沖體系與熱啟動酶的組合，有效抑制了非特異性的PCR擴增，顯著提高了PCR的擴增效率。該產品適用于無需ROX作為校正染料的熒光定量PCR儀，如：Roche LightCycler 480，Roche LightCyler 96，Bio-rad iCyler iQ，iQ5，CFX96。

試劑盒組成：

組份	1ml	5ml
2×SuperSYBR Mixture	1ml	5×1ml
ddH2O	1ml	5×1ml

產品特點
1、本產品中使用了全新熱啟動酶BaldStar Taq DNA Polymerase與獨特的PCR緩沖體系，顯著提高PCR的擴增效率，具有高靈敏度和特異性強的特點。
2、適用于熒光定量PCR檢測，能夠準確地對目的基因進行定量和檢測。

注意事項：
1、使用前請上下顛倒輕輕混勻，盡量避免起泡，并經短暫離心后使用。
2、本產品中含有SYBR Green I熒光染料，保存本產品或配制PCR反應液時應避免強光照射。
3、避免反復凍融本品，反復凍融可能使產品性能下降。
4、本品不能用于探針法熒光定量PCR。
5、配制反應液時，請使用新的或者無污染的槍頭和離心管，盡量防止污染。

操作步驟：
以下舉例為常規(guī)PCR反應體系和反應條件，實際操作中應根據(jù)模板、引物結構和目的片段大小不同進行相應的改進和優(yōu)化。

1、PCR反應體系

試劑	50μl反應體系	終濃度
2×SuperSYBR Mixture	2 5μl	1×
Forward Primer，10μM	1μl	0.2μM
Reverse Primer，10μM	1μl	0.2μM
Template DNA	2μl
ddH2O	up to 50μl

注意：
1)通常引物濃度以0.2μM可得到較好結果，可以終濃度0.1-1.0μM作為設定范圍的參考。
2)通常DNA模板的量以10-100ng基因組DNA或1-10ng cDNA為參照，因不同物種的模板中含有的目的基因拷貝數(shù)不同，可對模板進行梯度稀釋，以確定zuì佳的模板使用量。
3)推薦反應體系為50μl，也可以根據(jù)實際實驗需求按比例擴大或者縮小反應體系。

2、PCR反應程序：
注意！本產品預變性反應必須在95℃ 10分鐘下完成！

建議采用下表顯示的兩步法PCR進行程序設定，本程序是以ABI7500熒光定量PCR儀為例。若因Tm值較低的引物等原因，得不到良好的實驗結果時，可嘗試進行三步法PCR 擴增，三步法操作步驟詳見《反應條件的優(yōu)化》。

步驟	溫度	時間	循環(huán)數(shù)
預變性	95℃	10 min
變性	95℃	15 s	35-40 個循環(huán)
退火/延伸	60℃	1 min
融解曲線分析	95℃	15 s
	60℃	1 min
	95℃	15 s
	60℃	15 s

注意：
1)本產品所采用的熱啟動酶須在預變性95℃、10 min條件下實現(xiàn)酶的活化。
2)退火溫度請以60-64℃作為設定范圍的參考，發(fā)生非特異性反應時，可提高退火溫度。
3)本程序是以ABI 7500熒光定量PCR儀為參照設定，融解曲線分析請以所使用的熒光定量PCR儀推薦的程序進行設定。

反應條件的優(yōu)化：
在熒光定量反應條件優(yōu)化時，應從引物濃度、退火溫度、延伸時間等方面進行考慮，以提高反應特異性和擴增效率。
1、反應特異性和擴增效率高的實驗體系應具備以下條件：
1)反應特異性高：陰性對照無引物二聚體等非特異性擴增；不產生目的片段以外擴增。
2)擴增效率高：Ct值低；PCR擴增效率高，接近理論值。
2、反應條件優(yōu)化方法：
1)引物濃度：通常引物濃度以0.2μM可得到較好結果，可以終濃度0.1-1.0μM作為設定范圍的參考。若提高反應特異性，可降低引物濃度；若提高擴增效率，可增加引物的濃度，由此優(yōu)化反應體系。
2)退火溫度：建議采用兩步法PCR，退火溫度60℃進行反應。若提高反應特異性，可提高退火溫度，以60-64℃作為設定范圍的參考。若因使用Tm值較低的引物等原因，得不到良好的實驗結果時，可嘗試進行三步法PCR擴增，三步法的退火溫度請以56℃-64℃的范圍作為設定參考。
3)延伸時間：建議采用兩步法PCR，延伸時間1 min進行反應。若提高擴增效率，可嘗試將延伸時間增加，或嘗試三步法PCR。
注意！本產品預變性反應必須在95℃ 10分鐘下完成！

三步法熒光定量PCR(本程序是以ABI7500熒光定量PCR儀為例)：

步驟	溫度	時間	循環(huán)數(shù)
預變性	95℃	10 min
變性	95℃	10 s	35-40個循環(huán)
退火	56-64℃	30s
延伸	72℃	32s
融解曲線分析	95℃	15s
	60℃	1 min
	95℃	15 s
	60℃	15 s

注意：
1)本產品所采用的熱啟動酶須在預變性95℃、10 min條件下實現(xiàn)酶的活化。
2)無法得到理想的擴增效率時，適當降低退火溫度；發(fā)生非特異性反應時，提高退火溫度。
3)若需提高反應擴增效率，可適當增加延伸時間。
4)本程序是以ABI 7500熒光定量PCR儀為參照設定，融解曲線分析請以所使用的熒光定量PCR儀推薦的程序進行設定。

儲存條件：-20℃，避免反復凍融

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名稱：Babuddy超保真DNA聚合酶
貨號：WE0109
規(guī)格：100U
  Babuddy Super Fidelity DNA Polymerase是一種快速、高擴增效率的高保真DNA聚合酶，具有5"-3"DNA聚合酶活性和3"-5"外切核酸酶活性。經過改造的Babuddy Super Fidelity DNA Polymerase，其活性區(qū)域融合有一段聚合增強結構域，獨特的結構大提升了保真性和延伸速度。Babuddy Super Fidelity DNA Polymerase的保真性是普通Taq DNA Polymerase的50倍，是普通Pfu的6倍。其延伸速率為15-30 sec/kb，成功克服了普通Pfu酶擴增效率低、擴增速度慢的缺陷，大大縮短了反應時間。本品特別適合于在基因克隆實驗中擴增長片段DNA，尤其在擴增>10 kb的DNA片段時，更加明顯，所擴增的片段zuì長可達20kb。

  本產品中包含兩種PCR緩沖液，經過優(yōu)化的緩沖體系使酶的應用更加廣泛，即使以復雜的基因組DNA為模板，也可以保證很高的特異性和長片段的擴增。特有的PCR增強劑DMSO使GC含量高，有二級結構和重復序列的復雜模板也能得到擴增。

  使用本產品擴增得到的PCR產物的3"端不帶有“A”堿基，可直接克隆于平末端載體中。如需進行T/A克隆，需在PCR產物末端添加“A”后進行克隆。本產品具有延伸速度快、擴增效率高、保真性強的特點。適用于基因克隆、基因定點突變、SNP等實驗。

產品特點
1、高保真性：保真性是普通Taq DNA Polymerase的50倍，普通Pfu的6倍。
2、擴增速度快：其延伸速率為15-30sec/kb，成功克服了普通Pfu酶擴增效率低、擴增速度慢的缺陷。
3、特別適合于擴增長片段：擴增的片段長度可長達20kb。

產品組成：

組份	20μl×250次(100 U)
Babuddy DNA Polymerase，2U/μl	50μl
5×Babuddy HF Buffer	1.5ml
5×Babuddy GC Buffer	1.5ml
DMSO	0.5ml
50 mM MgCl2	1.5ml

注意：本產品的5×Babuddy HF 和GC Buffer中含有7.5 mM鎂離子。

活性定義：
在74℃，30分鐘內，將10 nmol脫氧核苷酸摻入到酸性不溶物質所需的酶量定義為1個活性單位(U)。

質量控制：
1、核酸內切酶活性檢測：50μl反應體系中，10 U本酶與0.2 mM dNTPs和1μg的pUC19質粒于37℃溫育4小時，<10%的pUC19質粒由超螺旋變?yōu)槿笨虪顟B(tài)。
2、7.5 kb基因組DNA PCR擴增：50μl反應體系，1×Babuddy HF Buffer，50ng基因組DNA，1 U Babuddy DNA聚合酶，200μM dNTPs和1μM引物，30個循環(huán)PCR擴增出7.5 kb目的片段。
3、20 kb λDNA PCR擴增：50μl反應體系，5×Babuddy HF Buffer，10ng λDNA，1 UBabuddy DNA聚合酶，200μM dNTPs和1μM引物，22個循環(huán)PCR擴增出20 kb目的片段。

使用方法：
以下舉例為常規(guī)PCR反應體系和反應條件，實際操作中應根據(jù)模板、引物結構和目的片段大小不同進行相應的改進和優(yōu)化。

1、PCR反應體系

試劑	20μl反應體系	50μl反應體系	終濃度
5×Babuddy HF Buffer	4μl	10μl	1×
dNTP Mix，2.5 mM each	1.6μl	4μl	200μM each
Forward Primer，10μM	1μl	2.5μl	0.5μM
Reverse Primer，10μM	1μl	2.5μl	0.5μM
Template DNA	適量	適量	<250ng
DMSO	0.6μl	1.5μl	3%
Babuddy DNA Polymerase	0.2 μl	0.5μl	1 U/50μl
ddH2O	up to 20μl	up to 50μl

注意：
1)對于復雜模板或高GC含量的模板，請使用5×Babuddy GC Buffer。
2)可選步驟：對于復雜模板，如高GC含量、帶有復雜二級結構的序列，可加入本產品中提供的DMSO或其他PCR添加物，以提高擴增效率，推薦終濃度為3%，也可按照2%的濃度遞增優(yōu)化。由于DMSO可以降低引物的Tm值，因此若DMSO使用濃度很高，需降低退火溫度。

a.模板：在50μl PCR反應體系中，DNA模板的建議用量為低復雜度模板(如質粒DNA，λDNA等)1 pg- 10ng，高復雜模板(如基因組DNA)50-250ng。
b.引物：引物濃度請以終濃度0.2-1.0μM作為設定范圍的參考，推薦終濃度為0.5μM。擴增效率不高的情況下，可提高引物的濃度；發(fā)生非特異性反應時，可降低引物濃度，由此優(yōu)化反應體系。
c.鎂離子：鎂離子濃度請以終濃度1.5-3 mM作為設定范圍的參考。本產品的 5×Babuddy HF Buffer和GC Buffer中已經含有7.5 mM鎂離子，可根據(jù)dNTP濃度、引物和模板來調整，由此優(yōu)化反應體系。若引物或模板中有螯合劑(如EDTA)存在，則應提高鎂離子濃度。若需要對鎂離子濃度進行優(yōu)化時，可使用本產品中提供的MgCl2按照0.5 mM濃度梯度逐步調整。
d.dNTPs：反應體系中dNTPs的濃度一般為每種200μM，使用本品時，不推薦使用dUTP和帶有尿嘧啶的引物或模板。
e.Babuddy酶的濃度：Babuddy酶推薦的使用濃度為1 U/50μl 反應體系，可在0.5-2 U/50μl 反應體系之間優(yōu)化酶的濃度。

2、PCR反應條件
常規(guī)三步法PCR反應：

步驟	溫度	時間	循環(huán)數(shù)
預變性	98℃	30 s-3 min
變性	98℃	5-10 s	25-35 個循環(huán)
退火	45-72℃	10-30 s
延伸	72℃	2-4 kb/min
終延伸	72℃	5-10 min

a．變性：簡單模板的預變性溫度為98℃，預變性時間為30 s。對于比較復雜的模板，預變性時間可延長至3分鐘。
b．退火：使用本產品時，退火溫度設定的基本原則是，當引物長度小于或等于20 nt時，退火溫度為引物zuì低的Tm；當引物長度大于20 nt時，退火溫度應在zuì低Tm的基礎上以Tm+3℃退火10-30 s。當無法得到理想的擴增效率時，應以zuì低的Tm值逐步提升至模板延伸溫度。對于Tm高的引物可以使用兩步法PCR。
c．延伸：延伸時間應根據(jù)所擴增片段的長度和模板復雜程度設定，本產品中所包含的Babuddy DNA Polymerase擴增效率為2-4 kb/min，復雜性低的模板可用4 kb/min，復雜性高的基因組DNA模板，延伸時間則應為2 kb/min，對于一些cDNA模板，延伸時間可增加到1.5 kb/min。
d．循環(huán)次數(shù)：可根據(jù)擴增產物的下游應用設定循環(huán)數(shù)。如果循環(huán)次數(shù)太少，擴增量不足；如果循環(huán)次數(shù)太多，錯配機率會增加，非特異性背景嚴重。所以，在保證產物得率的前提下，應盡量減少循環(huán)次數(shù)。

當引物的退火溫度較高時，建議使用兩步法進行PCR擴增：

步驟	溫度	時間	循環(huán)數(shù)
預變性	98℃	30 s-3 min
變性	98℃	5-10 s	25-35 個循環(huán)
延伸	72℃	2-4 kb/min
終延伸	72℃	5-10 min

儲存條件：-20℃，避免反復凍融。

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