北京百奧萊博供應的快速定點突變試劑盒用于生化實驗研究等領域，快速定點突變試劑盒是我司眾多優質基因結構和功能之一，質量堪比同類進口產品，價格非常優惠，目前正熱烈促銷中，恭候您的咨詢訂購。...

特別提示：包括快速定點突變試劑盒在內，本公司的所有產品僅可用于科研實驗，嚴禁用于臨床醫療及其他非科研用途！

產品名稱：快速定點突變試劑盒
英文名稱：Fast Site-Directed Mutagenesis Kit
產品貨號：WH0118
產品規格：20次

體外定點突變技術是當前生物、醫學各領域研究中的一種重要實驗手段，多用于改造、優化目的基因；探索啟動子的調節位點；以及研究蛋白質結構和功能之間的復雜關系。本試劑盒采用目前技術，可在目標載體上直接對靶基因進行單點突變，多點突變及插入或缺失突變，并且單點突變的突變率可達90%以上。另外，與以往的突變試劑盒需要多輪PCR及亞克隆等耗時耗力的步驟不同，本試劑盒的操作更為簡便，從未突變菌株到突變菌株的構建只需要4步，如下圖所示：


試劑盒提供的FastAlteration DNA Polymerase是一種快速高保真DNA聚合酶，該酶保真性能優良，靈敏度高，擴增速度可達15~30 sec/kb，并且zuì高可擴增長度為10 kb的質粒DNA。試劑盒附帶的FDM感受態細胞具有體內降解甲基化質粒的功能，可以對未被Dpn I降解掉的質粒模板進行進一步的降解，因此可以保證試劑盒具有更高的陽性率。同時，本試劑盒還為客戶提供了對照質粒和引物，方便客戶查找實驗問題。

產品特點：
·簡便快速：試劑盒采用非鏈取代式質粒擴增技術，只需4步即可實現由非突變菌株到突變菌株的轉變，而不需要多輪PCR及亞克隆等耗時耗力的步驟。
·引物：試劑盒采用部分重疊的引物設計原則，可以擴增得到更多的突變質粒。
·應用廣泛：本試劑盒不但可進行單點突變，還可以進行多點突變，且突變點數可達5個。
·適應性強：本試劑盒zuì大可對10 kb的質粒進行定點突變，基本覆蓋所有常用質粒。
·突變率高：本試劑盒具有體外和體內雙重消化甲基化質粒模板的功能，可以保證更高的突變率。對于單點突變而言，本試劑盒的突變率可達90%以上。

適用范圍：
·改造優化目的基因和載體；
·分析啟動子上與調控蛋白結合的關鍵位點；
·研究蛋白質結構和功能之間的關系。

試劑盒組成：

組分	規格
FastAlteration DNA Polymerase（1U/μl)	20μl
5× FastAlteration Buffer	200μl
Dpn I restriction enzyme（20U/μl)	20μl
4.5 kb Control plasmid（5ng/μl)	40μl
Control primers（5μM,each)	80μl
FDM competent cells	20×50μl

儲存條件：于-20℃條件下保存。感受態細胞-70℃條件下保質期6個月，試劑盒其他組分在-20℃條件下保質期1年。

注意事項
1．在進行單引物多位點突變時，由于增加了突變位點個數，所以突變率較單點突變時會有所降低，根據我們的實驗數據，當突變位點個數達到5個時，突變陽性率會降低到50%。因此建議客戶要增加驗證的克隆子數。
2．本試劑盒支持多引物多位點突變，這樣可以在基因內更廣泛的范圍內進行突變實驗。突變位點個數的上限仍然是5個。
3．建議在進行新的突變實驗時要帶上試劑盒附帶的對照質粒和引物，以便于對實驗問題進行分析。

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名稱：5′RACE試劑盒
貨號：BTN101105
規格：10次
研究真核基因的zuì基礎的工作之一就是確定其轉錄終止位點，目前zuì通用的方法是5′-RACE法，RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)是Frohman發明的、通過PCR快速克隆cDNA末端的技術，它在不建立cDNA文庫的前提下，利用已知cDNA序列設計引物，通過往兩端延伸和擴增獲得其5′-端序列。本試劑盒就是根據5′-RACE原理而開發。RACE的原理如下圖：


產品特點：
1. 即開即用，客戶不需要單獨準備各種材料。
2.反應條件經過精心優化，包括使用無RNase H活性的MMLV和優化的引物。

試劑盒組成：

成分	規格
MMLV逆轉錄酶-RI混合液(RNase H-，200U/μL)	10μl
MMLV Buffer-dNTP混合液	60μl
微量核酸沉淀劑	400μl
TdT(末端轉移酶)	10μl
2×TdT Buffer(含dATP)	100μl
PCR MagicMix 3.0	1.5ml
5′-RACE引物A-引物B混合液	100μl
5′-RACE引物C	100μl
RNase-Free水	1ml

儲存條件：低溫運輸、-20℃保存、有效期一年。

使用方法：

1.變性模板RNA：將1μg mRNA或5μg總RNA加入到一個RNase-free的PCR管中，補RNase-Free水到9μL，65℃保溫5分鐘后短暫離心，立即放冰上待用。如果RNA濃度偏低，體積超過9μl,可以使用本公司的核酸濃縮劑(需另購,產品編號為BTN110801)濃縮到所需的體積。
2. 設置RT反應(用戶可以根據需要設陰性對照)：在上步的含變性后的RNA模板的PCR管中，按順序加入：

成分	用量
自備的基因專一性引物A(10μM)	4μl
MMLV Buffer-dNTP混合液	6μl
MMLV逆轉錄酶-RI混合液	1μl
合計	20μl

3. 37℃保溫60分鐘，42℃保溫30分鐘，50℃保溫10分鐘，zuì后75℃保溫10分鐘使逆轉錄酶變性。
4. 短暫離心5秒后待用。
5.在PCR管中加入40μl微量核酸沉淀劑(本產品含不溶的核酸助沉劑，用前需要充分搖勻再取用)，震蕩混勻。
6.室溫12000rpm離心15分鐘，小心吸棄上清。
7. 加入1mL自備75%乙醇，室溫12000rpm離心5分鐘，小心吸棄上清。
8. 短暫離心數秒，小心吸棄殘留液體后，稍微晾干后加入10μL RNase-free水，充分吹打溶解，得到cDNA溶液。注意：為保證加尾效率，溶解cDNA的RNase-free水zuì好不要超過10μl。
9. 加尾反應：在10μL cDNA溶液中加10μL 2×TdT Buffer(含dATP)和1μL TdT酶，輕柔吹打混勻。
10. 37℃保溫15分鐘進行加尾反應，然后75℃保溫3分鐘滅活末端轉移酶。
11. 加入0.5mL RNase-free水稀釋加尾反應體系。此稀釋液將作為PCR的模板。
12. 輪PCR：用不同量的稀釋后的加尾反應液設置PCR反應(樣品組zuì好設用量梯度，單位：μL)。

成分	梯度1	梯度2	梯度3	梯度4
PCR MagicMix 3.0	25	25	25	25
自備基因專一性引物B(10μM)	2.5	2.5	2.5	2.5
5′RACE引物 A-引物B混合液	2.5	2.5	2.5	2.5
稀釋后的加尾反應液	1	5	10	15
RNase-free 水	19	15	10	5
合計	50	50	50	50

13. 按下列條件進行 PCR(注：應根據實際情況選擇適當的退火溫度)。
 第1次循環：94℃ 5分，48-52℃ 2分，72℃ 4分
 第2-30次循環：94℃ 40秒，52-60℃ 1分，72℃ 3分
 zuì后延伸：72℃ 15分
14. 取10-20μL PCR產物進行瓊脂糖電泳電泳檢查PCR結果，如果一條清晰的條帶，則可以不做后續的第二輪PCR，而直接進行 DNA 測序或TA克隆。
15. 第二輪PCR：如果輪PCR沒有一條清晰的條，則帶從4管PCR產物中各取1μL分別加入到20μL RNase-free水中進行稀釋，然后各取1μL分別作為4管第二輪PCR的模板：

成分	用量
輪 PCR產物的稀釋液	1μl
PCR MagicMix 3.0	25μl
5′RACE引物 C	2.5μl
自備基因專一性引物 C(10μm)	2.5μl
RNase-free 水	補水至50μl
合計	50μl

16. 按下列條件進行 PCR：第 1-30次循環(94℃ 40秒，52-60℃ 1 分，72℃ 3分)，zuì后延伸：72℃ 15分
17. 取10-20μL第二輪 PCR產物進行瓊脂糖電泳，一般都會有一個樣品有清晰的條帶出現，則可以直接進行DNA測序或TA克隆。

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