豬流行性腹瀉病毒RT-PCR檢測試劑盒是高品質的病毒PCR檢測試劑盒產品，由北京百奧萊博供應，本產品用于科研目的，我公司的豬流行性腹瀉病毒RT-PCR檢測試劑盒品質上佳，經(jīng)過多年的開發(fā)生產，已然非常成熟，歡迎廣大新老客戶訂購。...

特別提示：包括豬流行性腹瀉病毒RT-PCR檢測試劑盒在內，本公司的所有產品僅可用于科研實驗，嚴禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途！

產品名稱：豬流行性腹瀉病毒RT-PCR檢測試劑盒
英文名稱：Porcine epidemic diarrhea virus RT-PCR Kit
產品貨號：BTN11-4150
產品規(guī)格：50次

豬流行性腹瀉(Porcine Epidemic Diarrhea，PED)是由豬流行性腹瀉病毒(PEDV)引起的一種急性、高度接觸性腸道傳染病，對養(yǎng)豬業(yè)的危害大，所以及早確診對該病的防治具有特別重要的意義。豬流行性腹瀉病毒的傳統(tǒng)診斷方法主要有病毒的分離鑒定、免疫熒光抗體試驗、免疫電鏡觀察和ELISA等方法。但這些方法操作過程繁瑣、操作難度大，所需要時間較長，專一性不強因此建立一種快速、高靈敏度的診斷方法對防治PEDV感染是十分必要的。

PEDV屬于冠狀病毒科(Coronaviridae)冠狀病毒屬(Coronavirus)，其基因組為單鏈正股RNA，其中膜蛋白(M)基因高度保守。本研究根據(jù)PEDV的M基因設計特異性檢測引物，提供了PEDV的快速、靈敏的鑒別診斷方法，采用RT-PCR技術檢測疑似感染仔豬糞便或腸道組織樣品中的PEDV。

產品特點：
1. 用于PEDV的定性鑒定檢測和分子流行病學調查。
2. 能對樣品中PEDV進行快速檢測，具有良好的特異性和敏感性。
3. 使用一管式RT-PCR試劑盒，減少了操作步驟，降低了操作誤差。

產品組成：

組分	編號	規(guī)格(50T)
雙酶一管式RT-PCRBuffer，2×	BTN91202A	750μL
MMLV-Taq Mix	BTN91202B	100μL
PEDV專一性引物對	yw11611162	200μL
PEDV陽性對照	ct11611162	50 μL
超純水	BTN100935	1mL

保存條件：-20℃保存，有效期12個月。

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一、簡介：
本試劑盒針對諾如病毒通用型高度保守區(qū)域設計特異性引物和探針，在反應體系中含諾如病毒通用型基因組模板的情況下，PCR反應得以進行并釋放熒光信號。利用儀器對PCR過程中相應通道的信號強度進行實時監(jiān)測和輸出，實現(xiàn)檢測結果的定性分析。

二、用途：
諾如病毒(Norwalk Viruses，NV)是人類杯狀病毒科(Human Calicivirus，HuCV)中諾如病毒(Norovirus,NV)屬的原型代表株。有5個基因群(Gene group G)GI、GII、GIII、GIV、GV。諾如病毒感染性腹瀉在全范圍內均有流行，全年均可發(fā)生感染，感染對象主要是成人和學齡兒童，寒冷季節(jié)呈現(xiàn)高發(fā)。

三、試劑盒組成：(50T/Kit)
組份 數(shù)量 規(guī)格
RT-PCR反應液(NV-qRT-PCR MIX) 1管 672μL/管
酶混合物(Enzymes MIX) 1管 48μL/管
無核酸酶水(Nuclease-Free Water) 1管 500μL/管
陰性對照(NTC) 1管 50μL/管
陽性對照(NV-PTC) 1管 50μL/管

四、儲存條件及有效期：
本試劑盒于-20℃以下保存，有效期為6個月。

五、熒光PCR儀器適用范圍：
ABI系列，伯樂系列，Roche系列等熒光定量PCR檢測儀等。

六、樣品的采集與RNA提取
6.1 樣品的采集
1. 采集時間：糞便樣本應在發(fā)病日采集，至多不能超過發(fā)病急性期(48～72h)，此時為稀、軟便，病毒排出量zuì多。
2. 采集方法
(1)一次流行，至少采集10例患者糞便，每份樣本量約1～5mL，成形便和肛拭子診斷意義很小；
(2)病人嘔吐物是糞便樣本的zuì佳補充，有助于病原的診斷。采集、儲存和運送條件同于糞便；
(3)從流行病學角度出發(fā)，在水、食物或其它外環(huán)境樣本中檢出NV意義重要；
(4)需注意檢測技術要鎖定在高度懷疑的傳播媒介上，盡早采樣并置4℃存放，若是飲用水，需用大容量(5～100L)濃集病毒后檢測；
3.應避免樣本間交叉污染。
4.樣本收集后可立即檢測；若不能立即檢測，可置于-20℃以下過夜保存；如需長期保存，樣本應凍存于-70℃以下，避免反復凍融。
6.2 RNA提取
可采購北京百奧萊博科技有限公司的RNA提取試劑盒(過柱法-熒光配套)或其他合適的商業(yè)化產品，并按照相應試劑盒說明進行操作。
 注：陽性對照和陰性對照為已經(jīng)抽提好的核酸(無需提取)，直接取5μL加入到反應體系中即可。由于陽性對照濃度較高，建議zuì后在樣品制備區(qū)域加入陽性對照。

七、檢測步驟：
7.1 試劑的準備
從試劑盒中取出熒光qRT-PCR反應液(NV-qRT-PCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振蕩混勻后，10000rpm離心10s。
設所需要的PCR反應管管數(shù)為N(N=樣本數(shù)+1管陰性對照+1管陽性對照)，每個測試反應體系配制如下表：
試劑 每個反應加入的量 N個反應加入的量
熒光PCR反應液 14μL N×14μL
酶混合物 1 μL N×1μL
總量 15μL N×15μL
計算好各試劑的使用量，加入一適當體積潔凈離心管中，充分混勻，10000rpm離心10s，向設定的N個PCR反應管中分別加入15μL，向每管中加入處理后樣品/陰性對照(NTC)/陽性對照(NV-PTC)5μL，10000rpm瞬時離心10秒。
7.2 qRT-PCR反應條件
將各反應管放入實時熒光PCR儀器的反應槽內。
推薦循環(huán)條件:
反轉錄(Reverse Transcription) 1循環(huán) 45℃ for 10 min
預變性 1循環(huán) 95℃ for 10 min
PCR擴增 40循環(huán) 95℃ for 15 sec
60℃ for 45 sec
在55℃延伸時收集熒光信號。報告基團：設置為FAM，淬滅基團：NONE，請勿選擇ROX參比熒光。

八、結果分析：
8.1 結果分析條件設定
直接讀取檢測結果。基線和閾值設定原則根據(jù)儀器噪聲情況進行調整，以閾值線剛好超過正常陰性樣品擴增曲線的zuì高點為準。
8.2 試驗成立判定
（1） 陰性對照(NTC)：不應產生任何的擴增曲線。
（2） 陽性對照(NV-PTC)：均產生擴增曲線。
（3） 以上條件應同時滿足，否則，此次試驗視為無效。
8.3 結果判定
（1） 在試驗成立的條件下，Ct值≤35的樣本為陽性，表明NV核酸陽性。
（2） Ct值顯示為無的樣本為陰性樣本，表明NV核酸陰性。
（3） 如果35＜Ct值≤40，判為可疑樣品。對于可疑樣品，先看擴增曲線。如果擴增曲線為對數(shù)擴增曲線，則為可疑陽性，否則判為陰性。
（4） 對于可疑陽性樣品，重新抽提核酸，再次進行NV qRT-PCR檢測。如果重復擴增曲線為對數(shù)擴增曲線，判為樣本陽性，表明NV核酸陽性；否則判為樣本陰性。

九、注意事項：
（1） 初次使用前請仔細閱讀說明書。并嚴格按照說明書步驟操作。
（2） 所有使用的離心管zuì好高壓滅菌，而且必須不含RNA酶。
（3） PCR操作應嚴格按照要求分區(qū)(試劑配制區(qū)、標本處理區(qū)、PCR擴增區(qū)等)，防止實驗室污染。
（4） 樣本提取、試劑配置、加樣需在不同區(qū)的超凈工作臺進行，以免污染。
（5） 試劑盒里所有物品應視為污染物對待，并按照衛(wèi)生部《微生物生物醫(yī)學實驗室生物安全通則》進行處理。


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